Fuente: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Unidad de Linfopoyesis, Departamento de Inmunología, Instituto Pasteur, París, Francia
² INSERM U1223, París, Francia
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, París, Francia
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Citometría y Biomarcadores UtechS, Centro de Ciencias Traslacionales, Instituto Pasteur, París, Francia

La defensa contra los patógenos depende de la vigilancia del sistema inmunitario. Este sistema es complejo y comprende muchos tipos de celdas, cada uno con funciones específicas. Esta compleja composición permite respuestas inmunitarias a una gran diversidad de patógenos y lesiones. La inmunidad adaptativa permite respuestas específicas contra patógenos específicos. La mayoría de las células responsables de este tipo de inmunidad son los linfocitos (células B y células T). Por lo general, las células B responden a infecciones extracelulares (como infecciones bacterianas) y las células T responden a infecciones intracelulares (como infecciones virales). Los diferentes tipos de células en las poblaciones de linfocitos se pueden caracterizar por la combinación de proteínas de superficie celular que expresan y/o por un panel de citoquinas secretadas.

La clasificación magnética permite el enriquecimiento de las poblaciones celulares objetivo utilizando propiedades magnéticas y la expresión de una o varias proteínas de superficie celular (1, 2). Esta técnica consta de tres pasos. En primer lugar, las células se incuban con cuentas magnéticas que se acoplan con uno o varios anticuerpos monoclonales específicos. Las células que expresan proteínas superficiales que se unen a estos anticuerpos se unen a las cuentas magnéticas. Luego, las poblaciones celulares objetivo son capturadas con un imán. Para terminar, las células objetivo se eluyen del imán. Al final, se obtienen dos productos de clasificación, uno que contiene células sin etiquetar y el segundo que contiene las células diana junto con las cuentas magnéticas. Las columnas se pueden utilizar para mejorar la eficiencia de la clasificación magnética. En la columna, un elemento no magnético alarga la ruta de la celda a través de la columna. Por lo tanto, el flujo celular se ralentiza, facilitando la captura celular por el imán.

Figura 1: Representación esquemática de separación magnética. Los leucocitos timicos están manchados con anticuerpos biotinilados anti-CD3. Después del lavado, las perlas acopladas con estreptavidina (SAV) fijan específicamente la biotina en anticuerpos anti-CD3. (1) Las celdas se transfieren en una columna. (2) El imán no retiene las células sin etiquetar, mientras que las células CD3-positivas permanecen en la columna. Finalmente, la columna se separa del imán y (3) las células CD3-positivas se eluyen en medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Existen dos tipos de clasificación magnética (3). En la clasificación positiva, las células de interés se capturan con las cuentas magnéticas. En la clasificación negativa, las células no deseadas se eliminan capturando con las cuentas magnéticas que llevan los anticuerpos apropiados. Esta técnica MACS permite un buen enriquecimiento de células específicas y mejora el porcentaje de células recuperadas de 1-20% a 60-98% en un órgano. Después de la clasificación, es necesario verificar la pureza de la célula y la clasificación por diferentes métodos (por ejemplo, citometría de flujo). La técnica MACS es ideal para enriquecer una población objetivo para otros experimentos como el cultivo celular o el análisis del ciclo celular.

En este ejercicio de laboratorio, demostramos cómo aislar leucocitos timicos y, a partir de entonces, enriquecer las células timómicas CD3-positivas de la mezcla utilizando la técnica de clasificación de células magnéticas.