基于免疫沉淀的技术：使用阿加玫瑰珠纯化内源性蛋白质

资料来源：苏珊娜·希斯^勒1，托尼娅·^韦伯1
¹马里兰大学巴尔的摩分校微生物学和免疫学系，MD 21201

免疫沉淀（IP，也称为"下拉"测定）是一种广泛使用的技术，在各种领域都有应用。它于1984年首次构思，1988年经过提炼（1，2）。IP 的基本目标是使用针对该蛋白质的抗体对特定蛋白质进行纯化和分离。"免疫"一词是指使用抗体，而"沉淀"一词是指从溶液中拉出特定物质。目标蛋白可能是内源性或重组蛋白。大多数重组蛋白都有一个表位标记（即myc或标志）附着在它们上，以简化随后的纯化。通常，优化重组蛋白 IP 更容易，因为针对重组表位标记的抗体非常强和有效。针对内源性蛋白质的抗体具有极其可变的疗效 - 使得优化这些 IP 更加困难。免疫沉淀后的一个必要步骤是纯化验证。分离的蛋白质使用SDS-PAGE解决，随后由西方血带探查纯度（图1）。一个重要的控制是在西方印块期间使用不同的抗体来验证正确蛋白质的提取。IP 与后续技术的结合是一种强大的分析工具。纯化后的目标可能是通过NMR、质谱和体外测定对蛋白质本身进行表征，或分析蛋白质的相互作用伙伴（即蛋白质、DNA、RNA）（3、4、5）。

图1：免疫沉淀程序概述。免疫沉淀是使用抗体分离特定蛋白质。从细胞中生产分解后，有两个主要步骤-预清除和拉下。在预清除步骤中，细胞解物预先清除使用等型对照抗体与非特定抗体结合的蛋白质。在下拉步骤中，使用蛋白质特异性抗体将目标蛋白拉下。分离的蛋白质然后由西方斑点进行分析。等型抗体和蛋白质特异性抗体具有相同的恒定域，但抗原结合域不同。该协议的一个关键成分是蛋白质A/G腺珠，它结合抗体的恒定域-允许目标蛋白的免疫沉淀。请点击此处查看此图的较大版本。

抗体是免疫沉淀的关键成分，它区别于其他形式的蛋白质纯化（即镍亲基柱纯化）。抗体是由B细胞制成的分子，可以识别特定的蛋白质表皮。抗体有两个域：常数（Fc）和抗原结合（Fab）（图1）。常量域识别抗体的类型，并指示体内的功能。通常，用于IP的抗体的恒定域是小鼠、大鼠或兔子IgG。抗体的抗原结合部分识别特定蛋白质的特定表位。抗体可以识别折叠蛋白上的缩影，当蛋白质变性时，这些蛋白质可能不存在，反之亦然。因此，表位的可用性取决于蛋白质折叠 - 识别在选择抗体和IP条件时要考虑的重要因素。

原核素和真核系统都有抗体结合蛋白。在真核系统中，目的是免疫保护细菌，而在原核系统，目的是保护免疫系统。抗体结合蛋白以两种方式影响 IP 方法。首先，有必要的预清除步骤（图1）去除结合抗体的蛋白质的解结-从而减少最终产品中的非特异性结合。此步骤使用同型抗体，其恒定域与蛋白质特异性抗体不同，但抗体结合域不同。细菌抗体结合蛋白是该方法的第二个关键成分。在蛋白质特异性抗体结合靶蛋白后，抗体：蛋白质复合物必须被拉下（图1）。蛋白质A、G和L是结合抗体恒定领域的细菌蛋白。虽然细菌用它来破坏免疫系统，研究人员已经加入这个系统，以方便抗体纯化，它用于预清除和下拉步骤。这些蛋白质对于不同的物种和不同的恒定域亚型有不同的结合亲和力-在选择知识产权条件时需要考虑的另一个因素。许多公司销售标有A/G标记的甘蔗珠（图1）、预制旋转柱或树脂来制造柱。通常，珠子和旋转柱用于较小的样品尺寸，而树脂用于散装纯化。

在本实验练习中，我们演示如何使用基于蛋白质 A/G Plus 的腺苷酸腺苷酸细胞从原生鼠胸腺细胞中纯化内源性蛋白 c-myc。该协议从细胞分解液制备开始，最后通过西方斑点分析验证成功的蛋白质提取。

1. 使用蛋白质 A/G PLUS 加蔗珠进行免疫沉淀

细胞莱沙处理

在13，000rpm的微离心机中将10⁸胸腺细胞离心3分钟，并去除上清液。
注意：细胞数量将因所需蛋白质的表达水平和所选细胞类型而异。
用PMSF重新悬浮500μL裂化缓冲液RIPA中的细胞。
使用几个带涡旋的快速脉冲破坏细胞，然后用25G的针头在注射?...

上文详细介绍的过程结果如图 2 所示。从左到右，通道包含对照组（等型）、测试组（c-myc）、预清除裂化（裂化）和分子量阶梯（阶梯）。标记了 25 和 75 kDa 梯子带。#25 kDa 和 50 kDa 的两个突出带分别是结合抗体的轻链和重链，并且对 IP 或样品不特定。c-myc蛋白在西斑上运行约67kDa，通常在75 kDa梯带下方可见。在此印贝中，c-myc 波段在第二条通道中可见，但在第一通道中?...

简而言之，免疫沉淀是使用抗体分离特定蛋白质。在本例中，通过西方污点分析免疫沉淀的结果，以评估纯度。分离的蛋白质可用于随后的多种应用，包括：用于蛋白质结构的NMR、氨基酸序列的质谱法或用于酶表征的体外测定。IP 还可以描述蛋白质的相互作用伙伴的特征。例如，在分离后，DNA或RNA可以分离进行测序。共免疫沉淀评估蛋白质-蛋白质的相互作用。当目标蛋白在IP过程中被拉下?...

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