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세포주기 분석: 세포주기 CFSE 염색 및 유세포 분석을 사용한 자극 후 CD4 및 CD8 T 세포 증식 평가

Overview

출처: 퍼셰 티보1,2,3,뮤니에 실뱅1,2,3,소피 노볼트4,레이첼 골럽1,2,3
1 림프포에이시스 단위, 면역학학과, 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스
2 INSERM U1223, 파리, 프랑스
3 유니버시테 파리 디드로, 소르본 파리 시테, 셀룰레 파스퇴르, 파리, 프랑스
4 흐름 세포측정플리트에서, 세포측정및 바이오마커 UtechS, 번역 과학 센터, 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스

세포 주기는 생활의 보편적인 과정입니다. 세포 주기 도중, 세포는 2개의 딸 세포로 분할하기 위하여 몇몇 수정을 겪습니다. 이 기계장치는 그것의 필요에 응하여 유기체의 생활 내내 생깁니다. 세포 분열과 배아 발달은 단세포 zygote에서 완전한 유기체를 생성합니다. 성인기 동안 세포 주기는 조직 수리와 같은 많은 중요한 생물학적 과정의 중심입니다.

세포 분열의 메커니즘은 세포가 최종 분열 전에 단계별 수정을 겪는 엄격하게 통제된 사건입니다. 사이클에 아직 없는 세포는 갭 0(G0)상에 있는 것으로 설명된다. 이 단계에서 세포는 정지로 간주됩니다. 세포가 순환하기 시작하면 갭 1 (G1),합성 (S), 갭 2 (G2)및 미토시스 (M)의 네 가지 뚜렷한 단계가 인식됩니다. G1 단계는 DNA 합성을 위한 세포에 의해 필요한 자원에 대 한 체크 포인트. 그런 다음, S 상이 발생하고 DNA 복제가 시작되고,G2 interphase, 세포가 분할하는 데 필요한 모든 요소를 제어하는 또 다른 검사점. 마지막으로, 세포는 미토시스에 들어가 두 개의 딸 세포로 나눕니다.

세포 분열은 많은 다른 생물학적 시스템에서 매우 유익한 매개 변수입니다. 면역학 분야에서 백혈구 증식의 분석은 면역 반응의 메커니즘을 나타낼 수 있습니다. 조사의 다른 도메인은 또한 세포 주기 분석에 의존합니다. 예를 들면, 종양 발달 도중 세포 주기의 분석은 암의 우리의 이해를 향상했습니다.

많은 형광염료는 이제 세포 증식을 추적할 수 있습니다. 이러한 염료는 화학 적 특성과 스펙트럼 특성에 다릅니다. 염료의 두 가지 종류가 존재: 단백질 염료 영구적으로 공유 결합을 형성 하 여 단백질과 결합, 그리고 막 염료 안정적으로 강력한 소수성 협회를 통해 세포 막 내에서 상호 작용. 체세포세포에 의한 면역세포 증식의 체외생체 내 연구는 세포 추적 염료(1, 2)의 두 클래스의 가장 일반적인 응용 분야 중 하나이다.

CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르)는 세포를 나누는 것을 표시하는 형광 염료입니다. 처음에, 모든 세포는 염료의 동일한 양을 수신; 세포를 나누는 것은 그들의 두 딸 세포 사이에서 수신한 염료를 균등하게 분할합니다. 따라서, 세포 주기는 세포에서 염료 강도의 점진적인 감소에 선행될 수 있다. CFSE 염색은 CFSE 염색 정도(3)에 따라 세포의 현상과 기능적 특성화를 허용하는 고처리량, 형광계 기술인 기존의 다중 파라메트릭 흐름 세포측정법(3)에 선행된다.

다음 실험에서, 우리는 CFSE 염색 및 흐름 세포측정을 사용하여 CD3 자극에 따라 CD4+ 및 CD8+ T 세포의확산을 평가합니다.

Procedure

1. 준비

  1. 시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
  2. 먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 닦은 다음 철저히 닦아냅니다.
  3. 2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 50mL준비한다.

2. 해부

  1. 이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안?...

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Results

이 실험에서, 우리는 시험관 내 배양에서 비장 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 따랐습니다. 3 일 후, 우리는 자극의 유무에 관계없이 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에서 강한 증식을 볼 수 없었습니다. 이는 CSFE의 피크가 감소하지 않는 그림 2의 상단 패널에서 볼 수 있습니다. 그러나 5 일 후에, 우리는 CSFE 봉우리 (하단 패널,...

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Application and Summary

증식 분석은 세포의 활성화 정도를 결정하기 위해 면역학과 같은 다른 분야에서 자주 사용됩니다. 그것은 또한 환자에 있는 종양 공격성을 결정하기 위하여 종양학 진단에서 수행됩니다. CFSE 염색은 시간이 지남에 따라 면역 세포 인구의 증식을 따르는 유용한 기술입니다. 다른 방법은 세포 주기의 특성화를 허용합니다. BrdU는, CFSE의 동등한 것은 셀 분할에만 통합됩니다. 최근 Fucci 마우스 모델은 ...

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References
  1. Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
  2. Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
  3. Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).
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Concepts

2:33

Preparation of Materials and Dissection

3:30

CFSE Staining and T-Cell Stimulation

5:16

Cell Staining

7:08

Data Analysis

9:05

Results

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