Test de la plaque : méthode de détermination de la charge virale exprimée en unités formant des plaques

Source: Tilde Andersson¹, Rolf Lood^1
1 Département des sciences cliniques Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Suède

Les virus qui infectent les organismes procaryotes, appelés bactériophages ou simplement phages, ont été identifiés au début du^XXe siècle par Twort (1) et d'Hérelle (2) indépendamment. Les phages ont depuis été largement reconnus pour leur valeur thérapeutique (3) et leur influence sur les écosystèmes humains (4), ainsi que sur les écosystèmes mondiaux (5). Les préoccupations actuelles ont alimenté un regain d'intérêt pour l'utilisation des phages comme alternative aux antibiotiques modernes dans le traitement des maladies infectieuses (6). Essentiellement, toutes les recherches sur les phages reposent sur la capacité de purifier et de quantifier les virus, également connu sous le nom de titre viral. Initialement décrit en 1952, c'était le but de l'assiduité de la plaque (7). Des décennies et de multiples progrès technologiques plus tard, l'analyse de la plaque demeure l'une des méthodes les plus fiables pour la détermination du titre viral (8).

Les bactériophages subsisent en injectant leur matériel génétique dans les cellules hôtes, en détournant les machines pour la production de nouvelles particules de phage, et finalement en provoquant l'hôte de libérer de nombreuses virions progéniture par lyse cellulaire. En raison de leur taille infime, les bactériophages ne peuvent pas être observés à l'aide uniquement de microscopie légère; par conséquent, la microscopie électronique de balayage est nécessaire (figure 1). En outre, les phages ne peuvent pas être cultivés sur les plaques d'agar nutritionnelles comme les bactéries, car ils ont besoin de cellules hôtes pour s'en prendre à eux.

Figure 1 : La morphologie d'un bactériophage, ici illustrée par un phage E. coli, peut être étudiée à l'aide de la microscopie électronique à balayage. La plupart des bactériophages appartiennent aux Caudovirales (bactériophages à queue). Ce phage particulier a une structure de queue très courte et une tête icosaèdre, le plaçant dans la famille des Podovirus.

L'essai de plaque (figure 2) est basé sur l'incorporation des cellules hôtes, préférentiellement dans la croissance de phase de journal, dans le milieu. Cela crée une couche dense et turbide de bactéries capables de soutenir la croissance virale. Un phage isolé peut ensuite infecter, se répliquer et lyser une cellule. Avec chaque cellule lysée, plusieurs cellules adjacentes deviennent immédiatement infectées. Plusieurs cycles dans, une zone claire (une plaque) peut être observée dans la plaque autrement turbide (figure 2B/figure 3A), indiquant la présence de ce qui était initialement une particule bactériophage unique. Le nombre d'unités de formation de plaques par volume(c.-à-d. PFU/mL) d'un échantillon, peut donc être déterminé à partir du nombre de plaques générées.

Figure 2 : Le dépistage des unités de formation de plaque (PFU) est une méthode courante pour déterminer le nombre de bactériophages dans un échantillon. (A) La base d'un plat stérile Petri est recouverte d'un milieu nutritif solide approprié, suivie d'un mélange de milieux mous, de cellules hôtes sensibles et d'une dilution de l'échantillon de bactériophage d'origine. Notez que la suspension de phage pourrait, dans certains cas, également être répartie uniformément sur la surface de l'agar mou déjà solidifié. (B) La croissance des bactéries hôtes forme une pelouse de cellules dans la couche supérieure d'agar. La réplication des bactériophages génère des zones claires, ou plaques, causées par la lyse des cellules hôtes.

Figure 3 : Les résultats des tests PFU montrent plusieurs plaques générées par des bactériophages. En raison de la lyse des cellules hôtes sensibles, les plaques peuvent être considérées comme des zones de dégagement dans la pelouse bactérienne, soit avec (A) dégagement complet, soit (B) re-croissance partielle causée par la génération de bactéries résistantes (ou peut-être par des phages tempérés dans le cycle lysogénique).

Certains phages tempérés peuvent adopter ce qu'on appelle un cycle de vie lysogénique, en plus de la croissance lytique précédemment décrite. En lysogénie, le virus assume un état latent par l'incorporation de son matériel génétique dans le génome de la cellule hôte (9), conférant souvent une résistance à d'autres infections phages. Cela se révèle parfois par un léger obscurcissement de la plaque (figure 3B). Il est intéressant de noter cependant, que les plaques peuvent également apparaître floues en raison de la repousse des bactéries qui ont évolué résistance au phage indépendamment des infections phage précédente.

Les virus peuvent se fixer, ou adsorb, à seulement une gamme limitée de bactéries hôtes (10). Les plages d'hôtes sont encore limitées par des stratégies antivirales intracellulaires telles que le système CRISPR-Cas (11). La résistance/sensibilité à l'égard de phages spécifiques affichés par les sous-groupes bactériens a toujours été utilisée pour classer les souches bactériennes en différents types de phages (figure 4). Bien que l'efficacité de cette méthode ait maintenant été surpassée par de nouvelles techniques de séquençage, la dactylographie peut encore fournir des informations précieuses sur les interactions bactéries-phage, par exemple, en facilitant la conception d'un cocktail de phage pour une utilisation clinique .

Figure 4 : Sensibilité aux phages de différentes souches bactériennes. Des plaques d'agar molles avec la souche d'acné de Cutibacterium (A) AD27 et (B) AD35, ont été repérées avec 21 bactériophages différents de C. acnes. Seul phage 11 a été en mesure d'infecter et de tuer AD27 tandis que la souche AD35 a montré une sensibilité envers tous les phages. Cette technique, appelée dactylographie phage, peut être utilisée pour diviser les espèces bactériennes et les souches en différents sous-groupes basés sur la susceptibilité au phage.