플라크 분석: 플라크 형성 단위(PFU)로서 바이러스 역가를 결정하는 방법

출처: 틸드 앤더슨^1,롤프 루드^1
1 임상 과학 룬드학과, 감염 의학 학과, 생물 의학 센터, 룬드 대학, 221 00 룬드, 스웨덴

박테리오파지 또는 단순히 파지에게 불린 대핵 생물을 감염시키는 바이러스는, Twort (1) 및 d'Hérelle (2)에 의해 20^세기 초에 독립적으로 확인되었습니다. 파지는 이후 널리 그들의 치료 값 (3) 및 인간에 미치는 영향에 대 한 그들의 영향에 대 한 인식 되었습니다 (4), 글로벌, 생태계 (5). 현재의 관심사는 전염병의 치료에 현대 항생제에 대한 대안으로 파지의 사용에 대한 새로운 관심을 연료 (6). 본질적으로 모든 파지 연구는 바이러스를 정화하고 정량화하는 능력에 의존합니다, 또한 바이러스 성 미터로 알려진. 처음에 1952년에 기술된, 이것은 플라크 분석의 목적이었습니다 (7). 수십 년 후 여러 기술 발전, 플라크 분석 바이러스 성 titer의 결정에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 방법 중 하나 남아 (8).

박테리오파지(Bacteriophages)는 유전 물질을 숙주 세포에 주입하고, 새로운 파지 입자의 생산을 위해 기계를 납치하고, 결국 숙주를 세포 용해를 통해 수많은 자손 비리를 방출하도록 유도함으로써 자손을 주입합니다. 그들의 분 크기 때문에, 박테리오파지는 전적으로 가벼운 현미경 검사를 사용하여 관찰될 수 없습니다; 따라서 전자 현미경 검사가 필요합니다 (그림 1). 또한, 파지는 박테리아와 같은 영양 한천 접시에 재배 할 수 없습니다, 그들은 에 먹이 호스트 세포가 필요하기 때문에.

도 1: 대장균 파지에 의해 본래 예시된 박테리오파지의 형태는, 주사 전자 현미경 검사를 사용하여 연구될 수 있다. 대부분의 박테리오파지는 코도바이인(꼬리 박테리오파지)에 속한다. 이 특정 파지는 매우 짧은 꼬리 구조와 icosahedral 머리를 가지고, Podoviruses의 가족에 배치.

플라크 분석(그림 2)은 로그 상 성장에서 우선적으로 배지로 숙주 셀을 통합하는 것을 기반으로 합니다. 이것은 바이러스 성 성장을 유지할 수 있는 박테리아의 조밀 한, 탁탁 층을 만듭니다. 분리된 파지는 이후에 감염, 복제 및 한 세포를 lyse수 있습니다. 각 lysed 세포로, 다중 인접 한 것 들은 즉시 감염 되 면. 여러 사이클에서, 명확한 영역(플라크)은 그렇지 않으면 탁탁판(도 2B/도 3A)에서관찰될 수 있으며, 이는 처음에 단일 박테리오파지 입자의 존재를 나타낸다. 시료의 부피당 플라크 형성단위(즉, PFU/mL)의 개수는 생성된 플라크 수로부터 결정될 수 있다.

도 2: 플라크 성형 유닛(PFU)에 대한 테스트는 샘플에서 박테리오파지수를 결정하는 일반적인 방법입니다. (A) 멸균 페트리 접시의 베이스는 적절한 고체 영양소 배지로 덮여 있으며, 그 다음으로 소프트 미디어, 취약한 숙주 세포 및 원래 의 박테리오파지 샘플의 희석이 뒤섞인다. 파지 서스펜션은 경우에 따라 이미 고형화된 소프트 한천의 표면을 고르게 퍼뜨릴 수도 있습니다. (B) 숙주 박테리아의 성장은 상단 천층에서 세포의 잔디를 형성한다. 박테리오파지 복제는 숙주 세포 리시스로 인한 명확한 영역 또는 플라크를 생성합니다.

그림 3: PFU 테스트 결과 박테리오파지에서 생성된 여러 플라크가 표시됩니다. 취약한 숙주 세포의 용해로 인해 플라크는 (A) 전체 클리어런스와 함께 세균 잔디의 클리어링 영역으로 볼 수 있으며, (B) 내성 박테리아의 생성에 의한 부분적인 재성장(또는 리소겐성 사이클의 온대 파지에 의해).

특정 온대 파지는 이전에 설명된 lytic 성장 이외에 리소겐성 수명 주기라고 하는 것을 채택할 수 있습니다. 리소겐에서, 바이러스는 호스트 세포의 게놈에 그것의 유전 물질의 통합을 통해 잠복 상태를 가정합니다 (9), 수시로 추가 파지 감염에 저항을 수여합니다. 이것은 때때로 플라크의 약간의 흐린을 통해 드러난다 (그림 3B). 그러나, 그 플라크는 또한 이전 파지 감염의 독립적인 파지에 저항을 발전시킨 박테리아의 재성장 때문에 흐리게 나타날 수 있다는 것을 주목할 가치가 있습니다.

바이러스는 제한된 범위의 숙주 박테리아(10)에만 부착하거나 흡착할 수 있습니다. 호스트 범위는 CRISPR-Cas 시스템(11)과 같은 세포내 항 바이러스 전략에 의해 더욱 제한됩니다. 세균 성 하위 그룹에 의해 표시되는 특정 파지에 대한 저항 /감도는 역사적으로 다른 파지 유형으로 세균균을 분류하는 데 사용되어 왔다 (도 4). 이 방법의 효과는 이제 새로운 시퀀싱 기술에 의해 능가되었지만, 파지 타이핑은 여전히 박테리아 파지 상호 작용에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다, 예를 들어, 임상 사용을위한 파지 칵테일의 디자인을 촉진.

그림 4: 다른 세균균의 파지 감도. Cutibacterium 여드름 균주 (A) AD27 및 (B) AD35와 부드러운 천 접시, 21 다른 C. 여드름 박테리오파지로 발견되었다. 만 파지 11 감염 하 고 AD27을 죽일 수 있었다 동안 변형 AD35 모든 파지에 대 한 감도 를 보였다. 이 기술, 라는 파지 타이핑, 파지 감수성에 따라 다른 하위 그룹으로 세균종과 균주를 분할 하는 데 사용할 수 있습니다.