Name: visualizing the live drosophila glial-neuromuscular junction with fluorescent dyes
Uploaded: 2009-05-13T00:00:00
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このプロジェクトは、CIHRとNSERCによって資金を供給された。我々はDsRedのラベルが付いたSSR（BJライン）、およびUBCバイオイメージング施設を表すフライ株の創造に貢献するためのバーブJusiakに感謝します。

パート1：組織の準備<ol><li>私たちの目標は、神経系が損なわれていないハエの幼虫の組織の準備ですが、体壁筋の内側表面は人工の血リンパにさらされている、と近くに良い光学用顕微鏡のカバーガラスに配置することができます。言い換えれば、幼虫の準備裏返し。 従来の組織の準備が、カットピニングと体壁の筋肉をストレッチし、時には神経系の一部を除去を伴うので、私?...

<ol>
	<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Vesicles:+Test+for+a+role+in+presynaptic+Calcium+regulation.">Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li><li>Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals.">Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).</li><li>Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+calcium-channel+currents+in+normal+and+csp+mutant+Drosophila+peptidergic+terminals.">Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals.</a> Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).</li><li>Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla&#168;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Function+of+the+Blood&#8211;Brain+Barrier+in+Drosophila.">Organization and Function of the Blood&#8211;Brain Barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li></ol>

この手順では、ライブ標識タンパク質や細胞プロセスの長期的なイメージングを可能にします。私たちが説明の現場組織の準備はそのまま機能しCNS、PNSと反射回路を持っています。この組織の準備は、幼虫の体壁の筋肉が引き伸ばされている標準の幼虫のフライ筋肉プロトコル、（これが外部に固定されている場合）上の利点があります。ストレッチングシナプス形態を歪曲し、反射?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium.</td>
<td>Reagent</td>
<td>NA</td>
<td>NA</td>
<td>5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma).
2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph.
References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004
</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
<td>D34680</td>
<td>Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-HRP-CY5 conjugate (goat)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson ImmunoResearc</td>
<td>123-175-021</td>
<td>Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at &#x2013;20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa 647 antibody labeling kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
<td>A10475</td>
<td>We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling.</td>
</tr>
<tr>
<td>Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379</td>
<td>Reagent</td>
<td>Cargill Labs</td>
<td>Custom Formulated</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine Forceps</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tolls</td>
<td>11252-23 or 11295-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spring scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>91500-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra fine clipper scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15200-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion Chamber RC 20 Series</td>
<td>Tool</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>64-02222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinning Disc confocal</td>
<td>Microscope</td>
<td>Quorum</td>
<td>Quorum Wave FX</td>
<td>Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing the live drosophila glial-neuromuscular junction with fluorescent dyes

私たちのプロジェクトは、開発途上幼虫のフライ神経筋シナプスでGFP標識したグリアの構造を同定した。ライブグリア - 神経筋シナプスの発達を見て、私たちは生きて無傷の幼虫の特徴を持っていた幼虫の組織の準備を開発するだけでなく、良好な光学特性を持っていた。この新しい製剤は、シナプスへの灌流液のアクセスを可能にした。我々は、ハエの幼虫を用い、人工体液中のそれらを浸し、そして、それらを冷却することによって、正常なリズム体の収縮を緩和。次に、各動物の後部のセグメントをオフに切開し、鈍虫ピンで体腔を後方に口の部分をプッシュ。これは靴下裏返しにして回すように、幼虫体壁をeverted。我々は、超微細解剖鋏で解剖を完了したので、体壁筋の内臓側を露出。 NMJにおけるグリアの構造は、グリア特異的プロモーターの制御下にGFPをターゲット膜を表明した。シナプス後膜、筋肉のSSR（シナプス胞体）がシナプスDsRedを対象と表明した。我々は急性運動ニューロンの端末、シナプスの第三部にラベルを付ける必要がありました。これを行うために、我々は、遠赤色発光flurophoreに結合した、HRPに一次抗体を適用する。運動ニューロンの端末とSSRの間にperisynaptic空間に染料の拡散特性をテストするために、我々は、遠赤色発光flurophoreと収集した画像に結合した大規模なデキストラン分子の溶液を適用する。

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Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

我々は、共焦点顕微鏡で蛍光染料を使用して、ライブハエの幼虫の小説インサイドアウトの組織調製物におけるグリア - 神経筋シナプスの構造的特徴を説明した。我々は、HRPの蛍光灯の一次抗体とのライブニューロンの端末をラベル付けし、また蛍光デキストランでperisynapticスペースを可視化。

ライブの視覚化ショウジョウバエ</em蛍光色素で>グリア - 神経筋接合部

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

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JoVE Journal

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Biology

Unit 1

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Skeletal Muscle Relaxants

SCIENTISTS IN ACTION

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

生物学

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

の調製ショウジョウバエ</emハンギングドロッププロトコルを使用してライブイメージングのための>胚

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

の心臓の鼓動の可視化ショウジョウバエ</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

モザイク大人のライブイメージングのためのトマト/ GFP-FLP / FRT方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;視細胞

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

ライブの視覚化ショウジョウバエグリア - 神経筋接合部