Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
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Matériel et méthodes <ol><li> Les souches de levures <ul><li> Toutes les souches utilisées dans cette étude sont basées sur le fond BY4742. La souche de contrôle SILAC (Mat A, his3, leu2, ura3, lys2 et arg4:: G418) a été faite par l&#39;accouplement arg4 souche suppression (Mat A, his3, ura3, leu2, et arg4:: G418) pour BY4742 (Mat alpha, his3, leu2, ura3 et lys2), et les haploïdes méiotique ont été obtenus par dissection tétrade. Par conséquent, la souche de contrôle ...

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	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

Les aliquotes enregistrées au cours de la procédure de purification doit inclure (1) lysat de cellules pré-autorisé, (2) fraction liée, fraction libre (3), et (4) fraction éluée. Nous vous recommandons d&#39;analyser les teneurs en protéines des aliquotes ci-dessus par Western blot utilisant des anticorps anti-anticorps ou TAP coloration à l&#39;argent afin de refléter l&#39;efficacité de fixation et d&#39;élution de l&#39;expérience. Exemples d&#39;un gel coloré à l&#39;argent et une tache sont présent?...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

Les lipides sont les constituants des membranes cellulaires qui fonctionnent comme des barrières et dans le cloisonnement des processus cellulaires, et récemment, aussi importantes molécules de signalisation intracellulaire. Cependant, contrairement aux protéines, les lipides sont des petites molécules hydrophobes que le trafic principalement par les routes mal décrits nonvesicular, qui sont supposé se produire à des sites de contact à membrane (MCS). MCS sont des régions où le réticulum endoplasmique (RE) fait un contact physique direct avec un partenariat organite, par exemple, la membrane plasmique (MP). La portion des ER ER-PM MCS est enrichi en lipides synthétiser des enzymes, ce qui suggère que la synthèse des lipides est dirigé vers ces sites et ce qui implique que MCS sont importantes pour le trafic des lipides. La levure est un modèle idéal pour étudier ER-PM PMRs raison de leur abondance, avec plus de 1000 contacts par cellule, et leur nature préservée chez tous les eucaryotes. Découvrir des protéines qui constituent MCS est essentielle pour comprendre comment le trafic des lipides est accompli dans les cellules, et comment ils agissent comme des molécules de signalisation. Nous avons trouvé que l&#39;ER appelé Scs2p localiser à ER-PM MSSC et est important pour leur formation. Nous nous concentrons sur la découverte des partenaires moléculaires de la Scs2p. Identification des complexes protéiques repose traditionnellement sur la première résolution échantillons protéine purifiée par électrophorèse sur gel, suivie par la digestion dans le gel des bandes de protéines et d&#39;analyse des peptides par spectrométrie de masse. Cette limite souvent l&#39;étude d&#39;un petit nombre de protéines. En outre, les complexes protéiques sont exposés à la dénaturation ou non des conditions physiologiques lors de la procédure. Pour contourner ces problèmes, nous avons mis en œuvre à grande échelle en protéomique technique quantitative d&#39;extraire des données impartiales et quantifiés. Nous utilisons l&#39;étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés en culture cellulaire (SILAC) à intégrer des noyaux d&#39;isotopes de base en protéines dans une souche témoin non balisé. Des volumes égaux de la culture marqués et non marqués, la culture SILAC marqués sont mélangés et lysées par broyage dans l&#39;azote liquide. Nous avons ensuite effectuer une procédure de purification par affinité pour abattre des complexes protéiques. Enfin, nous précipiter l&#39;échantillon de protéine, qui est prêt pour l&#39;analyse par chromatographie liquide à haute performance / spectrométrie de masse en tandem. Surtout, les protéines de la souche de contrôle sont marquées par l&#39;isotope lourd et va produire un changement de masse / charge qui peut être quantifiée contre les protéines non marqué dans la souche d&#39;appât. Par conséquent, les contaminants, ou une liaison non spécifique peut être facilement éliminé. En utilisant cette approche, nous avons identifié de nouvelles protéines de plusieurs qui localisent à l&#39;ER-PM MCS. Nous présentons ici une description détaillée de notre approche.

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Ici, nous décrivons une nouvelle technique quantitative en protéomique pour identifier les complexes protéiques chez Saccharomyces cerevisiae. Dans cette étude, nous avons utilisé la méthode SILAC avec purification par affinité suivie par spectrométrie de masse en tandem afin d&#39;identifier avec une grande spécificité les partenaires de liaison d&#39;une protéine ER, Scs2p.

Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

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Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Dosage de l&#39;adhésion et l&#39;invasion Agar chez S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Recherche

Biologie

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Protéomique pour identifier les protéines interagissant avec P2X2 canaux cationiques ligand-dépendants

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

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Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

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Etudier Instabilité génomique fonction de l&#39;âge en utilisant les S. cerevisiae Modèle chronologique Lifespan

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

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Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

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Cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

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Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

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Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...