Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
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Materiali e Metodi <ol><li> Ceppi di lievito <ul><li> Tutti i ceppi utilizzati in questo studio si basano sullo sfondo BY4742. Ceppo di controllo SILAC (Mat uno, his3, leu2, ura3, lys2 e Arg4:: G418) è stata fatta con l&#39;accoppiamento Arg4 ceppo cancellazione (Mat uno, his3, ura3, leu2 e Arg4:: G418) per BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 e lys2), e la haploids meiotico sono stati ottenuti mediante dissezione tetrade. Pertanto, il ceppo di controllo è un auxotroph di lisina e a...

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	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

Le aliquote salvati durante la procedura di purificazione dovrebbe includere (1) pre-cancellati lisato cellulare, (2) frazione legata, (3) frazione libera, e (4) frazione eluita. Si consiglia di analizzare il contenuto proteico del aliquote sopra mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-TAP o colorazione argento per riflettere l&#39;efficienza di legame e eluizione di questo esperimento. Esempi di un gel colorato d&#39;argento e una macchia sono mostrati in figura 1. Dal SILAC ci...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

I lipidi sono i componenti delle membrane cellulari che funzionano come barriere e nella compartimentazione dei processi cellulari, e di recente, come importanti molecole di segnalazione intracellulare. Tuttavia, a differenza delle proteine, i lipidi sono piccole molecole idrofobiche che il traffico principalmente da poco descritto percorsi nonvesicular, che si ipotizza che si verifichino presso i siti di contatto a membrana (MCS). MCS sono regioni in cui il reticolo endoplasmatico (ER) rende il contatto fisico diretto con una partnership organello, ad esempio, membrana plasmatica (PM). La porzione di ER ER-PM MCS è arricchita in lipidi sintetizzare gli enzimi, il che suggerisce che la sintesi dei lipidi si rivolge a questi siti e implicando che MCS sono importanti per il traffico dei lipidi. Il lievito è un modello ideale per studiare ER-PM MCS a causa della loro abbondanza, con oltre 1000 contatti per cella, e la loro natura conservata in tutti gli eucarioti. Scoprire le proteine ​​che costituiscono MCS è fondamentale per capire come si realizza il traffico lipidi nelle cellule, e come si comportano come molecole di segnalazione. Abbiamo trovato che un pronto soccorso chiamato Scs2p localizzare a ER-PM MCS ed è importante per la loro formazione. Il nostro obiettivo è scoprire i partner molecolari di Scs2p. L&#39;identificazione di complessi proteici si basa tradizionalmente sulla prima risolvere campioni di proteine ​​purificate mediante elettroforesi su gel, seguita da in-gel digestione delle bande proteiche e analisi dei peptidi mediante spettrometria di massa. Questo limita spesso lo studio di un piccolo sottoinsieme di proteine. Inoltre, complessi proteici sono esposti a denaturazione o non le condizioni fisiologiche durante la procedura. Per aggirare questi problemi, abbiamo realizzato un grande tecnica proteomica quantitativa per estrarre i dati imparziale e quantificati. Noi usiamo l&#39;etichettatura degli isotopi stabili di aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) per incorporare i nuclei di base di isotopi di proteine ​​in un ceppo di controllo senza tag. Volumi uguali di cultura tag e senza tag, la cultura SILAC marcati sono mescolati insieme e lisate dalla macinazione in azoto liquido. Abbiamo poi effettuare una procedura di purificazione di affinità di abbattere complessi proteici. Infine, precipitare il campione, che è pronto per l&#39;analisi ad alte prestazioni cromatografia liquida / spettrometria di massa tandem. Ma soprattutto, proteine ​​del ceppo di controllo sono etichettati dai isotopo pesante e produrranno una massa / carica spostamento che può essere quantificata contro le proteine ​​senza etichetta nel ceppo esca. Pertanto, contaminanti, o legame aspecifici possono essere facilmente eliminati. Utilizzando questo approccio, abbiamo individuato diverse nuove proteine ​​che localizzano a ER-PM MCS. Presentiamo qui una descrizione dettagliata del nostro approccio.

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Qui si descrive una nuova tecnica di proteomica quantitativa per identificare i complessi proteici in Saccharomyces cerevisiae. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo SILAC insieme purificazione di affinità seguita dalla spettrometria di massa tandem per identificare con elevata specificità dei partner legame di una proteina ER, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Test di adesione ed invasione di Agar in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Ricerca

Biologia

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomica per identificare proteine ​​che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

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Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

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Studiare età-dipendente instabilità genomica utilizzando il S. Saccharomyces Modello Durata cronologica

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flusso Cytometry basata Purificazione<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigoti

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...