Name: focal ca2+ transient detection in smooth muscle
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle at JoVE.com

De Wellcome Trust heeft financiële steun verleend (VIP Award uit aan JSY en 074.128 Research Fellowship aan KLB). Medical Research Council studententijd aan RJA Leica_SP2_Stacker, een algoritme gebruikt om de TIFF&#39;s importeren voor &#39;reconstructie&#39; in een reeks, is gebaseerd op Leica_tiff_sequence, een plugin voor het lezen van Leica SP2 TIFF&#39;s in ImageJ, ontwikkeld door Tony Collins en gebruikt met zijn toestemming. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg en TurboReg, zijn algoritmen die worden gebruikt om te corrigeren voor verplaatsing van weefsel, op basis van Th venaz en collega&#39;s (1998) 9. Excel_writer.jar werd geschreven door Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, het deeltje detectie-algoritme, is gebaseerd op een algoritme geschreven door KL Brain en eerder vijf gedetailleerd.

Deel 1: Voorbereiding van de Ca 2 +-indicator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) <ol><li> Oregon Green 488 BAPTA-1 wordt geleverd AM in 500 pi flacons als een kleine hoeveelheid (50 ug) van poeder. Voeg 40 ul Pluronic F-127 oplossing voor het poeder, schudden zachtjes gedurende 30 s, voeg dan 460 ul PSS, en schud voorzichtig gedurende 30 s. De uiteindelijke oplossing, 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, geeft 4 x 125 ul aliquots. Vermijd blootstelling aan licht en op te slaan bij -20 C. </li></ol> Deel 2: Ca 2 + geladen <ol><li> Verwijder de Ca 2 +-indicator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) van de (-20 C) diepvries en laat ontdooien bij kamertemperatuur. </li><li> Neem 1 ml van PSS in een reageerbuis en plaats in het water-bad. Bubble met 95% O 2 / 5% CO 2 met een snelheid van ongeveer 1 bubble verschijnen per seconde. De bubbler dient te worden bevestigd in de test-buis, bijv. met een stop of met Parafilm. </li><li> Ontleden het weefsel van het dier, en in een Sylgard gevoerde petrischaal, verwijder voorzichtig bindweefsel. Onafhankelijk van de gladde spieren orgel type, moet PSS vervangen worden elke 10 minuten en weefsel moet goed worden gewassen (bijvoorbeeld door het vervangen van de PSS drie keer) na dissectie. Voor de zaadleider: denk aan het snijden van het orgel lengte manieren om een ​​blad van het weefsel te produceren. Voor de urineblaas: open lengterichting van de blaashals (posterior) naar de top van de koepel (anterior). Bereiden vier strips, 6 - 8 mm lang en 1 - 2 mm breed, langs het dorsale oppervlak van de detrusor, het snijden in de richting van de dominante spier bundels. </li><li> Plaats ontleed weefsel in de &#39;pre-verwarmd en borrelde&#39; PSS. </li><li> Voeg 125 ul van 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM om de test-tube en geef een beetje schudden, met de hand, om te mengen. </li><li> CV borrelen en laat, afgedekt met folie. De tijd is duurt voor voldoende weefsel te maken van de Ca 2 +-indicator varieert met de grootte van weefsel en de dikte van de gladde spierlaag. Bijvoorbeeld: 70 minuten (muis detrusor, rat anococcygeus) tot 120 min. (rat detrusor, muis vas deferens). </li></ol> Deel 3: Voorbereiden van de &#39;Ca 2 + geladen&#39; weefsel voor microscopie Zorgvuldige pinning van het weefsel is nodig om spontane beweging van het weefsel (een eigenschap van de beeldvorming van de gladde spiercellen van relatief intact weefsel) te minimaliseren en om de locatie van een geschikte plaats voor de beeldvorming (als een plat stukje weefsel kan vergemakkelijken onderzocht in twee dimensies, in plaats van drie). <ol><li> Spoel het weefsel in borrelde PSS gedurende minstens 5 minuten. </li><li> Mount in Sylgard gevoerde voorbereiding gerecht, dat zich uitstrekt van het weefsel (licht) om een ​​vlakke plaat te vormen. Vermijd het gebruik van lange &#39;pinnen&#39; dat het doel kan krassen, te gebruiken in plaats korte lengtes van 25-50 micrometer diameter zilverdraad als &#39;pinnen&#39; en invoegen op een hoek. </li><li> Plaats de schotel voorbereiding op de microscoop podium, zorg ervoor te zorgen dat de PSS niet ontsnappen aan de Sylgard omzoomde gebied van de schotel (omdat dit kan leiden tot een groot gebied worden behandeld in PSS, toen de superfusie begint). </li><li> Schakel de pomp in om de voorbereiding superfuse met PSS. Een tarief van 100 ml per uur wordt vaak gebruikt. </li><li> Schakel de verwarming unit. </li><li> Plaats de in-en uitstroom buizen en temperatuursonde aan de voorbereiding schaal (het aanbrengen van elk van de metalen strip door de magneet op zijn basis). De hoogte van de tip van de uitstroom buis bepaalt de diepte van de PSS. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat de uitstroom in feite is het verwijderen van PSS (omdat het soms niet in eerste instantie). </li><li> Stel de temperatuur op de kachel unit op de gewenste temperatuur, bijvoorbeeld 33 tot 35 C. te bereiken </li><li> Laat het weefsel in evenwicht gedurende minstens 10 minuten. </li></ol> Deel 4: Keuze van de site om de afbeelding Blootstelling aan excitatie verlichting zal de indicator photobleach, dus vermijd het gebruik van voor meer dan een paar seconden per keer. <ol><li> Met een laag vermogen doelstelling (10x of 20x) gebruik epifluorescentie, spannend met een blauw licht, om de gladde spieren te bekijken en een geschikte regio om toezicht te houden identificeren. Probeer een site op basis van pick: beweging (dat moet minimaal zijn) en het aantal van gladde spiercellen in het veld. Bright &quot;structuren&quot; kan een groot aantal &#39;false positives&#39; in het beeld detectiealgoritme veroorzaken, dus vermijd sites met grote aantallen (bijvoorbeeld) afgewisseld epitheliale cellen of fibroblasten. </li><li> Schakel over naar een hogere macht doelstelling (40x). </li><li> Draai het podium of de optische as, zodat de gladde spiercellen (s) ligt horizontale (dat wil zeggen parallel aan de snelle scan as). </li></ol> Deel 5: confocale microscopie De details van hoe de confocale microscoop is &#39;set up&#39; zijn specifiek voor elke microscoop type, maarde belangrijkste overwegingen zijn: snelheid (minimaal 5 Hz is vereist voor de meeste Ca 2 + overgangen), resolutie en grootte van het veld (die beide worden verhandeld-off met snelheid). Sommige van de volgende protocol is specifiek voor een Leica SP2 rechtop confocale microscoop. Een typische protocol is: 100 beeld-serie, verwierf op 5 Hz (256 x 256 pixels; ca. 100 x 100 micrometer.) Of 13,5 Hz (256 x 64 pixels, ca. 100 x 25 pm.). Het scannen kop ingesteld op bi-directioneel te verplaatsen (de verwerving snelheid te maximaliseren) en bij 1000 Hz per regel te verwerven. <ol><li> Sluit het gaatje om een ​​&#39;luchtige disk&#39;. </li><li> Stel de laser (488 nm) de macht tussen de 25 en 35% op de AOTF: deze waarde wordt een trade-off tussen helderheid en fotobleking. (De laatste is vooral een probleem bij lange opnamen.) </li><li> Verwerven zes series per site, en vier - zes vestigingen per &#39;behandeling&#39;. Is het gebruikelijk om te streven naar dezelfde zes sites pre-drug (dat wil zeggen &#39;control&#39;) en post-drug monitor, hoewel ook hier belangrijke fotobleken kan de experimentator af te wijken van dit. </li><li> Het is essentieel met Ca 2 + imaging dat de &#39;time controls&#39; worden uitgevoerd. </li></ol> Deel 6: Voorbereiding voor de analyse <ol><li> Download en installeer Image J uit: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Download de platform-specifieke versie, en dan updaten naar de nieuwste versie van downloaden van de nieuwste imageJ.jar bestand van http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, ter vervanging van het oude bestand. Apple Mac-gebruikers: als het werkt langzaam, zorg ervoor dat je de laatste versie van de Java Virtual Machine (JVM), verkrijgbaar bij Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/) gebruikt. </li><li> Download Excel_writer.jar uit: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html en installeren in de Plugins [directory]&gt; jar directory. </li><li> Kopieer de volgende bestanden in de plugins directory: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installeer elk van deze scripts met de Plugins [Menu]&gt; Macro&#39;s&gt; Install ... functie van ImageJ. </li><li> We maken gebruik van een Leica SP2 confocale microscoop, de software (Leica LCS) waarvoor elke serie genereert als een zichtbaar &#39;movie&#39; binnen de software, maar bespaart als individuele frames. Te reconstrueren frames in de serie: (i) Zorg ervoor dat alle &#39;frames&#39; om gereconstrueerd te worden in een map (bijvoorbeeld &#39;DataFolder&gt; Tiffs&#39;). (Ii) Selecteer Plugins [Menu]&gt; Macro&#39;s&gt; Leica_SP2_Stacker. Selecteer de root directory (bijvoorbeeld &#39;DataFolder&#39;). Selecteer de gewenste map in de drop-down lijst (bijvoorbeeld &#39;Tiffs /&#39;). Selecteer een output directory of het genereren van een nieuwe (bijvoorbeeld &#39;DataFolder&gt; Stacks&#39;). Het script zal dan te reconstrueren series van individuele frames. </li></ol> Deel 7: Correctie voor beweging Hoewel beweging van de website afgebeeld kan worden geminimaliseerd met goede pinning en gelijkmatig-uitgerekt weefsel, sommige gladde spieren organen vertonen spontane weeën die niet kan worden opgeheven door een zorgvuldige pinnen alleen. Hier beschrijven we het gebruik van een vrij beschikbare algoritme dat aansluit of overeenkomt met frames in een serie. <ol><li> Download &#39;StackReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) en &#39;TurboReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Installeer elk in de Plugins map met behulp van de Plugins&gt; Macro&#39;s&gt; installeren ... </li><li> Plaats een stapel om te worden verwerkt (File&gt; Open ...) en vervolgens naar een frame dat duidelijk laat zien op het gebied van belang. Andere frames zullen worden afgestemd op dit referentiekader. </li><li> Plugins&gt; Stacks&gt; StackReg. Probeer elk van de verschillende &#39;Transformaties&#39; (dat wil zeggen Translation, Rigid Body, Geschaalde Rotation, Affine) om te bepalen wat het meest effectief is. (Meer informatie: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Deel 8: Particle detectie-algoritme Voor elke &#39;site&#39; belicht, zullen factoren variëren dat van invloed op de detectie van Ca 2 + transiënten. Door het meten van bepaalde eigenschappen van elke site (&#39;particle parameters&#39; - hieronder), is het proces van opsporing vergemakkelijkt. Dus voor elke site, een berekent &#39;drempel voor aftrek&#39;, &#39;drempel voor-ratio&#39; en &#39;cell edge drempel&#39;. <ol><li> Plugins [Menu]&gt; Macro&#39;s&gt; Install ... en selecteer &#39;JNCT0.08Release.ijm&#39;. </li><li> Plugins [Menu]&gt; Macro&#39;s&gt; belasting stack (sneltoets: l). Kies een serie en bereken deeltje parameters: <ol style="list-style:none;"><li> a. Drempel voor afgetrokken (= achtergrond) </li></ol></li><li> Selecteer een rechthoekige ROI over wat je geloven &#39;achtergrond&#39; te zijn. </li><li> Measure (sneltoets: m). Noteer MEAN. <ol style="list-style:none;"><li> b. Berekening van de drempel voor verhouding </li></ol></li><li> Selecteer een rechthoekigeROI rond een optisch vlakke oppervlakte van de cel (len). </li><li> Measure (sneltoets: m). Noteer gemiddelde en de standaarddeviatie. </li><li> Herhaal nog eens twee keer of je kunt tekenen drie dozen in een keer door op &#39;shift&#39;. </li><li> Berekenen en naar beneden drempel voor-ratio note = (1 + SD / gemiddelde) x 32, met een gemiddelde waarde van de drie herhalingen / sites. <ol style="list-style:none"><li> c. Cel rand drempel </li></ol></li><li> Afbeelding&gt; Stacks&gt; Z project ... Kies een projectie type: &#39;gemiddelde intensiteit&#39; </li><li> Afbeelding&gt; Aanpassen&gt; Drempel. </li><li> Selecteer zwart en wit. </li><li> Definieer &#39;onder&#39; (bovenste slider) te beperken en noteer de overeenkomstige waarde (aan de rechterkant van de slider). Alleen gebeurtenissen die zich in de zwarte regio&#39;s zullen worden geteld. </li><li> Klik op &#39;reset&#39;. </li><li> Analyse stacks (sneltoets: 2) </li><li> Selecteer gewoon een serie in dit stadium, dat wil zeggen de &#39;eerste file&#39; en &#39;laatste bestand&#39; moet hetzelfde zijn. </li><li> Voer waarden van de &#39;drempel voor aftrek&#39;, &#39;drempel voor-ratio&#39; en &#39;cell edge drempel&#39;. Laat andere instellingen op hun standaardwaarden. </li><li> Het algoritme zal een dual-ruit venster waarin de verwerkte serie wordt weergegeven op de linker-en het origineel aan de rechterkant. Zorgvuldig gaan door dit om het aantal valse positieven en de keren dat gebeurtenissen, zichtbaar op het oog, niet zijn ontdekt beoordelen. Om een meer nauwkeurige detectie van Ca 2 + transiënten kan het nodig zijn om iets aan te passen een aantal van de &#39;particle parameters&#39;. Terwijl het proces kan een beetje &#39;hit and miss&#39; lijkt bij de eerste poging, krijgt men al snel een gevoel van wat parameters centraal staan. </li><li> Voor elke serie, het algoritme produceert een Excel-bestand dat details de kenmerken van de gedetecteerde gebeurtenis (zoals amplitude, ruimte en positie). &#39;False positives&#39; - geïdentificeerd door de herziening van de image-bestanden die het algoritme uitgangen (bijv. stap 8.17) - kunnen worden verwijderd, met de hand van dit Excel-bestand. </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

Pogingen werden gedaan om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren; alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het Verenigd Koninkrijk Dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986 en de Europese Gemeenschappen van Richtlijn 86/09/EEC.

Keuze uit fluorescerende Ca 2 +-indicator Oregon Green 488 BAPTA-1 AM werd gekozen als de Ca 2 +-indicator, omdat het (i) is licht in vergelijking met andere indicatoren (bijv. Fluo-4 en Calcium Groen) 1, (ii) is gevoelig voor fysiologische veranderingen in Ca 2 +-concentratie met een K D van dezelfde orde van grootte 1 op de intracellulaire Ca 2 +-concentratie [Ca 2 +] i (bijvoorbeeld van vas deferens 2), (iii) laadt een groot aantal gladde spiercellen, waardoor gladde spiercellen koppeling te worden gecontroleerd. Echter, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM is een non-ratioable Ca 2 +-indicator, en als zodanig niet gemakkelijk kan worden gebruikt om de absolute bepalen [Ca 2 +] i. Bovendien kan het ook buffer Ca 2 + indien aanwezig in hoge concentraties en wordt verzadigd met een hoge amplitude veranderingen in [Ca 2 +] i. Remming van spontane contractiliteit De spontane contractiliteit van de gladde spieren organen kunnen farmacologisch worden verminderd, bijvoorbeeld door het blokkeren van de beweging van Ca 2 + door de L-type Ca 2 +-kanalen (bijv. door: nifedipine 3; diltiazem 4). Merk op dat deze medicijnen sterk zal de amplitude van whole-cell Ca 2 + flitsen / transiënten te verminderen. Contractie van de zaadleider resultaat van een combinatie van voornamelijk purinerge en noradrenerge neurotransmissie. Focus Ca 2 + transiënten in dit weefsel zijn echter ongevoelig voor noradrenerge receptor blokkade (bijv. α een adrenoceptor, door prazosine 5), zodat beweging kan worden verlaagd zonder dat dit invloed focale Ca 2 + transiënten. Als alternatief kan samentrekking worden voorkomen &#39;downstream&#39; door de remming van myosine lichte keten kinase, bijvoorbeeld door wortmannin 6. Conclusies Monitoring Ca 2 + fluorescentie bij submicron resolutie is een krachtige techniek om de post-junctionele effecten van neurotransmitters 5,7 bestuderen en het vrijkomen van Ca 2 + uit interne winkels (bijvoorbeeld &#39;vonken&#39; 8). De analyse van Ca 2 + transiënten het gebruik van de beschreven methode is hier rendabel in vergelijking met commercieel verkrijgbare beeldanalyse pakketten en maakt het mogelijk op maat gemaakte analyse door middel van op maat geschreven Java-plug-ins voor ImageJ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

Ca 2 + beeldvorming van het gladde spierweefsel geeft inzicht in cellulaire mechanismen die niet kan resulteren in veranderingen van de membraanpotentiaal, zoals de vrijlating van Ca 2 + van interne winkels, en maakt het mogelijk meerdere cellen tegelijkertijd worden gecontroleerd om, te beoordelen bijvoorbeeld, koppeling in syncytieel weefsel. Subcellulaire Ca 2 + transiënten komen vaak voor in de gladde spieren, maar zijn moeilijk nauwkeurig te meten, vanwege de problemen veroorzaakt door hun stochastische gebeurtenis, dan een vaak breed gezichtsveld, in een orgaan dat het gevoelig zijn voor contract. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een serie van beeldvorming protocollen en analyse routines om vervolgens te verwerven en te analyseren, op een geautomatiseerde manier, de frequentie, de locatie en de amplitude van dergelijke gebeurtenissen. Hoewel deze aanpak kan worden toegepast in een andere context, onze eigen werk bestaat uit het opsporen van de lokale purinerge Ca 2 + transiënten voor het lokaliseren van de zender release met submicron-resolutie. ATP is uitgebracht als een cotransmitter van de autonome zenuwen, waar het bindt aan P2X1 receptoren op de gladde spieren van de detrusor en de zaadleider. Ca 2 + komt in de gladde spieren, wat resulteert in purinerge neuroeffector Ca 2 + transiënten (NCTS). Het brandpunt Ca 2 + transiënten kan de optische controle van de neurotransmitters in een manier die veel voordelen ten opzichte van elektrofysiologie heeft. Afgezien van de sterk verbeterde ruimtelijke resolutie, optische recording heeft het extra voordeel dat de opname van de zender vrijlating uit een groot aantal te onderscheiden locaties tegelijk. Bovendien is de optische vlak van focus is makkelijker te onderhouden of te corrigeren tijdens de lange opname-serie dan is de herpositionering van een intracellulaire scherp micro-elektrode. Samengevat, is een methode voor de beeldvorming van Ca 2 + fluorescentie geschetst waarin de details van de voorbereiding van de weefsel, en de verwerving en analyse van gegevens. Schetsen we het gebruik van meerdere scripts voor de analyse van dergelijke Ca 2 + transiënten.

Watch this Scientific Journal Video about Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle at JoVE.com

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methoden voor hoge-resolutie Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Beeldvorming van het gladde spierweefsel in geïsoleerde organen, zoals: de voorbereiding van het weefsel, beeld-acquisitie en data-analyse.

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolatie van de Mens Umbilical arteriële gladde spiercellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolatie van longslagader gladde spiercel van Neonatale Muizen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle<em&gt; In Situ</em&gt; Met behulp van de TUNEL Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Murine Aortic Crush Injury: Een Efficiënt<em&gt; In Vivo</em&gt; Model van gladde spiercel proliferatie en endotheliale functie

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen met behulp van klik chemie

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in the aorta and regulates vasoconstriction and vasodilation. Mutations in genes encoding for the SMC contractile apparatus proteins are associated with aortic diseases, such as thoracic aortic aneurysms. Measuring SMC contraction in vitro is challenging, especially in a high-throughput manner, which is essential for screening patient material. Currently available methods are not suitable for this purpose. This paper presents a novel method based on electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). First, an explant protocol is described to isolate patient-specific human primary SMCs from aortic biopsies and patient-specific human primary dermal fibroblasts for the study of aortic aneurysms. Next, a detailed description of a new contraction method is given to measure the contractile response of these cells, including the subsequent analysis and suggestion for comparing different groups. This method can be used to study the contraction of adherent cells in the context of translational (cardiovascular) studies and patient and drug screening studies.

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

This paper describes an explant culture-based method for the isolation and culturing of primary, patient-specific human aortic smooth muscle cells and dermal fibroblasts. Furthermore, a novel method is presented for measuring cell contraction and subsequent analysis, which can be used to study patient-specific differences in these cells.

Isolatie van primaire patiëntspecifieke gladde spiercellen van aorta en semikwantitatieve real-time contractiemetingen in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...