Name: focal ca2+ transient detection in smooth muscle
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle at JoVE.com

Wellcome Trust оказывает финансовую поддержку (VIP Премия JSY и 074128 исследовательский грант на КЛБ). Совет по медицинским исследованиям Студенчество в RJA Leica_SP2_Stacker, алгоритм, используемый для импорта Формат TIFF для «реконструкции» в серии, основана на Leica_tiff_sequence, плагин для чтения Leica SP2 Формат TIFF в ImageJ, разработанный Тони Коллинз и используются с его разрешения. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg и TurboReg, алгоритмы, используемые для корректировки движения ткани, основаны на Th venaz и коллеги (1998) 9. Excel_writer.jar был написан Куртом Де Вос (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, алгоритм регистрации частиц, основан на алгоритме написана KL мозга и описаны ранее 5.

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

Были предприняты усилия, чтобы минимизировать число животных, используемых и их страдания, и все эксперименты были проведены в соответствии с животным Великобритании (Научно процедуры) Закона 1986 г. и Европейского Сообщества Директивы Совета 86/09/EEC.

Выбор флуоресцентных Са 2 + индикатор Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 утра был выбран в качестве Са 2 + индикатор, поскольку он (я) является яркой по сравнению с другими показателями (например, Fluo-4 и кальция зеленый) 1, (II) является чувствительным к физиологическим изменениям в концентрации Са 2 + с К г такого же масштаба 1 к внутриклеточной концентрации Са 2 + [Са 2 +] я (например, семявыносящих протоков 2); (III) загружает много гладких мышечных клеток, что позволяет гладко мышечных клеток связи для мониторинга. Тем не менее, Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 АМ без ratioable Са 2 + индикатор, и как таковые не могут быть легко использованы для определения абсолютных [Са 2 +] я. Кроме того, она может также буфера Са 2 + при наличии в высоких концентрациях и насыщается высокими изменения амплитуды [Ca 2 +] я. Подавление спонтанной сократительной Спонтанной сократительной способности гладких мышц органов может быть уменьшена фармакологически, таких как, блокируя движение Са 2 + через L-типа Ca 2 +-каналов (например, путем: нифедипин 3; дилтиазем 4). Обратите внимание, что эти препараты значительно уменьшит амплитуду цельноклеточная Са 2 + вспышек / переходных процессов. Сокращение семявыносящих протоков результатом сочетания в первую очередь purinergic и норадренергической нейротрансмиссии. Фокусное Са 2 + переходных процессов в этой ткани, однако, нечувствительны к норадренергической блокада рецепторов (например, α 1 адренорецепторов, по празозин 5), так что движение может быть уменьшена без изменения координационного Са 2 + переходных процессов. Кроме того, сокращение может быть предотвращено &quot;вниз&quot; через ингибирование миозина света, например, цепочку киназы вортманнином 6. Выводы Мониторинг Са 2 + флуоресценции при субмикронного разрешения мощную технику для изучения после соединительного эффекты нейромедиатора релиз 5,7 и выпуск Са 2 + из внутренних магазинах (например, «искры» 8). Анализ Са 2 + переходных использованием методологии, изложенной здесь является экономически эффективным по сравнению с коммерчески доступных пакетов анализа изображений и позволяет индивидуальные анализа с помощью специально написанный плагин Java для ImageJ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

Са 2 + визуализации гладких мышц обеспечивает понимание клеточных механизмов, которые не могут привести к изменениям мембранного потенциала, таких, как освобождение Са 2 + из внутренних магазинах, а также позволяет несколько ячеек для мониторинга одновременно оценить, например, в связи синцитиальный ткани. Субклеточных Са 2 + переходных распространены в гладкой мускулатуре, но трудно точно измерить из-за проблем, вызванных их возникновения стохастических, более часто широкое поле зрения, в орган, который она склонна к контракту. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали серию изображений протоколов и анализ процедур по приобретению и затем проанализировать, в автоматическом режиме, частоты, амплитуды и местоположение таких событий. Хотя такой подход может быть применен и в других контекстах, наша собственная работа включает в себя обнаружение локальных purinergic Са 2 + переходные для размещения передатчика релиз с резолюцией субмикронных. АТФ высвобождается в виде cotransmitter от вегетативных нервов, где он связывается с рецепторами на P2X1 гладкой мускулатуры детрузора и семявыносящих протоков. Са 2 + входит гладких мышц, в результате чего purinergic neuroeffector Са 2 + переходные (NCTS). Координационным Са 2 + переходных позволяют оптического мониторинга нейромедиатора выпуска таким образом, что имеет много преимуществ по сравнению с электрофизиологии. Помимо значительно улучшить пространственное разрешение, оптической записи имеет дополнительное преимущество, что позволяет запись передатчик освобождение от многих различимы сайтов одновременно. Кроме того, оптические плоскости фокуса легче поддерживать или исправить в течение длинного ряда записи, чем это репозиционирование внутриклеточных резкое микроэлектрода. Таким образом, метод для работы с изображениями Са 2 + флуоресценции в котором подробно изложил подготовки ткани, а также приобретение и анализ данных. Мы выделяем использованием нескольких сценариев для анализа таких Са 2 + переходных процессов.

Watch this Scientific Journal Video about Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle at JoVE.com

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Подробнее методы высокого разрешения Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Визуализации гладких мышц в изолированных органах, в том числе: подготовка ткани, получения изображений и анализа данных.

Фокусное Ca 2 + Переходные Обнаружение в гладкой мускулатуре

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Изоляция по правам артерии пуповины гладкомышечных клеток (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Изучение артериальной гладких мышц KV7 калиевых каналов функцию с помощью Patch Clamp электрофизиологии и давления Миография

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Выделение легочной артерии гладкомышечных клеток у новорожденных мышей

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Измерение гладких мышцах функции в выделенную ткань баня приложений к фармакологии исследований

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Погрузочно-разгрузочные работы и оксид азота производства в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированной аорты крыс

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Измерение флуктуаций кальция в пределах саркоплазматического ретикулума культивируемых клеток гладкой мышцы с использованием FRET на основе конфокальной микроскопии

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Выделение мышиной коронарных сосудов клетках гладкой мускулатуры

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Повреждение дрожь в аритмии: эффективный<em&gt; В Виво</em&gt; Модель гладкой мышечной клеточной пролиферации и эндотелиальной функции

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Измерение распространения сосудистых гладких мышечных клеток с помощью нажмите химии

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Выделение первичных клеток гладкой мускулатуры аорты, специфичных для пациента, и полуколичественные измерения сокращения в режиме реального времени in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...