Name: generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue
Uploaded: 2009-07-07T19:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue at JoVE.com

כדי לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים ברדס זרימה למינרית. 1. חומרים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P) (רכיבים: פתרון 1,2, 3 ו 4, מאגר אחסון) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום ההפרדה מסננים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) המיאלין חרוזים להסרת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטא mercaptoethanol </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> gentleMACS Dissociator </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MACSmix Rotator Tube </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (w / o) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (w) </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנקס &quot;שנאגרו מלח פתרון ללא קטיונים divalent Ca 2 + או Mg 2 + (HBSS (w / o) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS, סטנדרטי, כלומר עם Ca 2 + ו - Mg 2 + (HBSS (w) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם epitope את האנטיגן עניין ביישומים הבאים, להשתמש או Papain מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (P) או טריפסין מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (T). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים מן הרקמה עצבית דיסוציאציה קיט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2: להוסיף בטא mercaptoethanol מ&quot;מ 0.067 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 4: לפזר אבקת הצפת 0.7 מ&quot;ל אחסון (מסופק בערכה), לערבב בעדינות (לא מערבולת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזימים מערבבים 1: פתרון 1.9 מ&quot;ל פיפטה 2 ו 50 פתרון μl 1 (הן ערכה) לתוך צינור C ו דגירה של 10-15 דקות על 37 ° C. זה מספיק כדי לנתק 400 מ&quot;ג של רקמת המוח. </li></ol></li></ol> 2. Dissociating הרקמה העצבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את רקמת המוח בתוך שפופרת המכילה 1 מ&quot;ל HBSS (w / o) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העכבר המוח לתוך הצינור C המכיל 1950 μL של מיקס אנזימים שחומם מראש 1. (הערה: בפרוטוקול זה נכתב עבור 400 מ&quot;ג ≤, אבל כרכים פתרון וניתן לשנותם כדי להכיל עד 1600 מ&quot;ג של רקמת המוח לכל Tube C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית &quot;m_brain_01&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם סיבוב (4 סל&quot;ד באמצעות Rotator Tube MACSmix) במשך 15 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית &quot;m_brain_02&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלב דיסוציאציה להכין 30 μl של אנזימים מערבבים 2 מ&quot;ג לכל 400 ברקמת ידי ערבוב בעדינות 20 μl של פתרון 3 ו - 10 μl של פתרון 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מערבבים אנזימים 2 עד התחתית C באמצעות כובע, מחצה אטום ומערבבים בעדינות מבלי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית &quot;m_brain_03&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה לאסוף את דגימת בחלק התחתון של הצינור. </li></ol> 3. סינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מסנן מספיק גדול כדי לאפשר מעבר לתאים של עניין. למשל, תאים פורקינג&#39; הם גדולים מדי כדי לעבור דרך מסנן 30 מיקרומטר, אך Prominin-1 + תאים תהיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה μl suitable1000 כדי להסיר את התאים בצורה Tube C באמצעות כובע, מחצה אטום ולהחיל אותו מסנן ההפרדה מראש על צינור איסוף 15 מ&quot;ל. (הערה: עבור גודל מדגם גדול יותר להשתמש צינור איסוף 50 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את המסנן עם 10 מ&quot;ל של HBSS (w). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים מסוננים על XG 300 דקות 10 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend supernatent בינוני או חיץ של בחירה עבור יישומים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר פסולת מיאלין, המיאלין הסרת להשתמש חרוזים. </li></ol> 4. תוצאות נציג: אנא ראו איורים 1-3 <img src="/files/ftp_upload/1267/Fig_1.png" alt="תאנה 1" /> איור. 1 דיסוציאציה המוח עם Dissociator gentleMACS הביא תאים קיימא 97%, כפי שמראה ניתוח תזרים cytometric. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig2.png" alt="תאנה 2" /> איור. 2 תמונת מיקרוסקופ אור של היווצרות neurosphere לאחר מיון התא מגנטי באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads לאחר 7 ימים של טיפוח MACS ® NeuroMedium בתוספת MACS B27 מוסף PLUS. תאים שהוכנו מהמוח CD1 העכבר (P3), תוך שימוש ברקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P). <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig4.jpg" alt="תאנה 3.5" /> איור. 3 פסולת המיאלין של תא בודד המתלים פוגמת במידה ניכרת בידוד תא, סילוק פסולת המיאלין על ידי הסרת חרוזים המיאלין מגביר תא הפרדות יעילות. עבור הפרדות MACS באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads, P22 במוח העכבר היה ניתק באמצעות רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P). תאים ההשעיה תא בודד היו גם להשתמש ישירות עבור ההפרדה, או הוגשו המיאלין דלדול באמצעות חרוזים המיאלין הסרת. השוואת דגימות ללא הפרדה עם הסרת המיאלין, מוכיח כי הטוהר גבוהה יותר עבור דגימות עם הסרת המיאלין הקודם.

<ol>
	<li>Hardt, O., Scholz, C., K&#252;sters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+defines+differences+between+region-specific+GABAergic+neurons.">Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).</li><li>Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response.">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li><li>K&#246;rnyei, Z., G&#243;cza, E., R&#252;hl, R., Orsolits, B., V&#246;r&#246;s, E., Szab&#243;, B., V&#225;govits, B., Madar&#225;sz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia-derived+retinoic+acid+is+a+key+factor+in+glia-induced+neurogenesis.">Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis.</a> FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).</li><li>Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TNF-family+receptor+DR3+is+essential+for+diverse+T+cell-mediated+inflammatory+diseases.">The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases.</a> Immunity. 29, 79-89 (2008).</li><li>Skog, J., W&#252;rdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T., Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li></ol>

הכותבים הם עובדי Miltenyi BIOTEC GmbH, גרמניה.

Dissociator gentleMACS מאפשר הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מרקמות עצביים במערכת סגורה. רקמה עצבית ערכות דיסוציאציה מותאמים לשמר epitopes אנטיגן הדרושים יישומים נוספים כמו immunostainings והפרדה תא immunomagnetic 1-5. בפרוטוקול זה אנו מראים ניתוק האנזימטית עדין של המוח באמצעות העכבר Dissociator gentleMACS ואת הרקמה העצבית דיסוציאציה Kit (P), מניב בתאים קיימא 97%. 100 מ&quot;ג של רקמה עצבית התשואות בין 6 5x10 ו 1x10 7 תאים, בהתאם לגיל של רקמות המאכסן. ממוקד Prominin-1 + תאים בודדו באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads ונלקח לאחר מכן לתוך התרבות. הפרוטוקול מוצג להיות אפילו יותר יעילה עם שימוש נוסף של חרוזים המיאלין הסרת כשעובדים עם רקמה עצבית נגזר P7&gt; עכברים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>C Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-237</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>gentleMACS&#x2122; Starting Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-235</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MACSmix&#x2122; Tube Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-090-753</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-092-628</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Pre-Separation Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-041-407</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Prominin-1 MicroBeads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-092-333</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Prominin-1-APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-092-335</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Myelin Removal Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-094-544</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Art 1000 Reach Pipet Tips </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular BioProducts</td>
<td>Order no. 2079</td>
<td><a href="http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61">http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61</a> 
<a href="http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html">http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Neural Tissue Dissociation Kit (T)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-231</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-233</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue

בתוך מערכת העצבים, מאות סוגי תאים עצביים ועל גליה תוארו. כל סוג תא מסוים במוח או בחוט השדרה יש רפרטואר של פני השטח מולקולות התא, או גורמים המולקולרית, שבאמצעותה ניתן זוהו ואופיינו. נכון לעכשיו, זיהוי תאים חזקים טכנולוגיות הפרדה דורשים תא בודד ההכנות להיות שנוצר ובמקביל הגבלת מוות של תאים והרס של חלבון משטח אופייני. Dissociator gentleMACS, כאשר בשילוב עם טריפסין או papain מבוססי ערכות דיסוציאציה, יכול ביעילות ובעדינות לנתק את רקמת המוח תוך שמירה epitopes אנטיגן והגבלת אובדן התא. הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מושגת באמצעות צינורות C, אופטימיזציה, תוכניות מראש gentleMACS. לאחר שנוצר, תא בודד השעיות יכולים להיות מטופלים עם conjugates חד שבטיים כמו אנטי Prominin microbeads-1, אשר לזהות אבות עצביים, או מטוהרים נוסף באמצעות חרוזים המיאלין הסרת.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue at JoVE.com

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

דור טובולואידים כליות אנושיים מרקמות ושתן

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...