Name: detection of protein ubiquitination
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00
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California Institute for Regenerative Medicine gewährt RS1-00331-1 und RL1-00682-1 (bis Z. Zhang);; die amerikanische Parkinson Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt RO1 DC006497, RO1 NS057289 und PO1 ES016738 (bis Z. Zhang) unterstützt Disease Association (bis Z. Zhang und YS Choo) und die Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research (Z. Zhang).

Detektion von Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen <ol><li> Transfizieren kultivierten Zellen mit Plasmiden, die das Protein exprimieren von Interesse und (Epitop-markierte Version von) Ubiquitin. </li><li> Machen Sie komplette Zell-Lyse-Puffer (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) mit 2 mM Natriumorthovanadat, 50 mM Natriumfluorid und Protease-Inhibitoren. </li><li> Lyse-Zellen mit 100 ul Zell-Lyse-Puffer pro Platte (6 cm Schale). Wenn eine größere Schüssel verwendet wird, die Lautstärke entspre...

<ol>
	<li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1,+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation.">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li><li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity.">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li><li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF5,+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization.">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li><li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination.">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li></ol>

In dieser Präsentation haben wir zum ersten Mal beschrieben Schritte, die Erkennung Ubiquitin Änderung auf ein Protein von Interesse in Säugetierzellen zu erlauben. Um Ubiquitinierung spezifisch nachzuweisen auf das Protein von Interesse, nicht auf nicht-kovalent interagierende Proteine, verwendeten wir eine stringente Bedingung für Zell-Lyse, Immunpräzipitation und Waschen 1,3. Ubiquitination, durch Immunpräzipitation von Zielprotein in solch rauen Bedingungen durch Anti-Ubiquitin-Immunoblot gefolgt er...

detection of protein ubiquitination

Ubiquitinierung, die kovalente Bindung des Polypeptids Ubiquitin an Proteine ​​Ziel, ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Dazu gehören Ubiquitin-aktivierende Enzym E1, Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 und E3-Ubiquitin-Ligase. Im Gegensatz zu E1 und E2, E3 Ubiquitin-Ligasen Display Substratspezifität. Auf der anderen Seite haben zahlreiche deubiquitylating Enzyme Rollen in der Verarbeitung polyubiquitinierte Proteine. Ubiquitination kann zu einer Veränderung der Stabilität des Proteins, zelluläre Lokalisation und biologischen Aktivität führen. Mutationen von Genen in die Ubiquitinierung / deubiquitination Weg oder verändert Ubiquitin-System-Funktion beteiligt sind, mit vielen verschiedenen Krankheiten wie verschiedene Arten von Krebs, Neurodegeneration und metabolischen Erkrankungen. Der Nachweis von veränderten oder normale Ubiquitinierung von Target-Proteinen kann zu einem besseren Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankungen. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen erkennen<em&gt; In vivo</em&gt; Und Reagenzgläser<em&gt; In-vitro-</em&gt;. Diese Protokolle sind auch nützlich, um anderen Ubiquitin-ähnlichen kleinen Molekülen Modifikation wie sumolyation und neddylation erkennen.

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Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen erkennen<em&gt; In vivo</em&gt; Und Reagenzgläser<em&gt; In-vitro-</em&gt;.

Detektion von Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...