Name: detection of protein ubiquitination
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones RO1 DC006497, RO1 NS057289 y PO1 ES016738 (A a la Z. Zhang), Instituto de California para la Medicina Regenerativa subvenciones RS1-00331-1 y RL1-00682-1 (A a la Z. Zhang), el Parkinson estadounidense Asociación de la Enfermedad (A a la Z. Zhang y Choo YS) y la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson (Z. Zhang).

La detección de la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas <ol><li> Transfectar células cultivadas con plásmidos que expresan la proteína de interés y (epítopo de etiquetado de la versión) ubiquitina. </li><li> Hacer búfer completo lisis celular (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) con ortovanadato de sodio 2 mM, 50 mM de fluoruro de sodio, y los inhibidores de la proteasa. </li><li> Lisis de las células con 100 l buffer de lisis celular por placa (6 cm plato). Si un plato más grand...

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	<li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1,+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation.">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li><li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity.">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li><li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF5,+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization.">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li><li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination.">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li></ol>

En esta presentación, lo primero que describió las medidas que permitan detectar modificaciones ubiquitina a una proteína de interés en los cultivos de células de mamíferos. Con el fin de detectar la ubiquitinación específicamente en la proteína de interés, no en las proteínas que interactúan de forma no covalente, se utilizó una condición estricta para la lisis celular, inmunoprecipitación y el lavado de 1,3. Ubiquitinación, detectado por inmunoprecipitación de la proteína diana en un estad...

detection of protein ubiquitination

Ubiquitinación, la unión covalente de la ubiquitina polipéptido que se dirigen a proteínas, es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Estos incluyen la activación de la enzima ubiquitina E1, E2 ubiquitina-conjugación enzima, y ​​E3 ubiquitina ligasa. A diferencia de E1 y E2, E3 ubiquitina ligasas pantalla especificidad de sustrato. Por otro lado, numerosas enzimas deubiquitylating tienen un papel en el procesamiento de las proteínas polyubiquitinated. Ubiquitinación puede resultar en un cambio de la estabilidad de las proteínas, localización celular y la actividad biológica. Las mutaciones de los genes implicados en la vía de ubiquitinación / deubiquitination o alteración de la función del sistema ubiquitina están asociados con muchas enfermedades diferentes humanos, tales como varios tipos de cáncer, neurodegeneración, y trastornos metabólicos. La detección de ubiquitination alterado o normal de las proteínas diana pueden proporcionar una mejor comprensión de la patogénesis de estas enfermedades. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas<em&gt; In vivo</em&gt; Y tubos de ensayo<em&gt; In vitro</em&gt;. Estos protocolos son también útiles para detectar otras ubiquitina-como la modificación de moléculas pequeñas como sumolyation y neddylation.

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Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas<em&gt; In vivo</em&gt; Y tubos de ensayo<em&gt; In vitro</em&gt;.

La detección de ubiquitinación de proteínas

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Lote de inmunotinción para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro del mono entero

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Investigación

Biología

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

En Vivo Detección y análisis de la sumoilación de la proteína Rb en células humanas

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...