Name: dna extraction from 0.22 &mu;m sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Extraction from 0.22 ÃŽÂ¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

Vi vill tacka det kanadensiska institutet för innovation, British Columbia Kunskap utvecklingsfonden och Statens Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Kanada för att stödja pågående studier på låg syre regioner i kustnära och öppna hav vatten. JJW stöddes av stipendier från NSERC och DAW stöddes av stipendier från NSERC, Killam och Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution. SL fick stöd av Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution.

Anmärkning: Alla reagenser som används i detta protokoll alikvoteras från lab lager i mindre arbetsgrupper lager-detta är mycket viktigt för att undvika korskontaminering av ditt DNA-prov och förorening av lab lager. Även vid pipettering, se till att ändra pipettspetsar för varje tillägg för att undvika korskontaminering. Del ett: cellslys och matsmältning <ol><li> Börja detta protokoll med upptining av Sterivex filter som innehåller tidigare koncent...

<ol>
	<li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+BAC+or+not+to+BAC:+marine+ecogenomics.">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li><li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage.">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li><li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior.">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li><li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+uncultivated+prokaryotes:+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon.">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li><li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments.">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li></ol>

Beroende på hur många prover som ska bearbetas, kan detta vara en tidskrävande procedur på grund av de två en-timmes inkubation steg, och de upprepade tvättar och steg centrifugering. Det är bäst att planera två hela dagar för detta förfarande att lämna gott om tid. Om det finns problem att få den slutliga extrakt volymen i Amicon röret för att minska ner till 200-500μl under DNA-koncentration och tvättning, prova att göra ytterligare TE tvättar och centrifugering (upprepa tredje delen) tills rätt vo...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 cc syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml eppendorf tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>0030 125.150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS430791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5cc syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon&reg; Ultra-4 Centrifugal Filter Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC801096</td>
<td>10,000 Nominal molecular weight limit</td>
</tr>
<tr>
<td>Butanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A383-1</td>
<td>Make it water saturated (butanol:water = 1:1)</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge rotor, JA5.3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>368690</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge, Avanti&reg; J-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>369003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroform:IAA (24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>25666-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide (EtBr)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E1510-10ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-247-10</td>
<td>37&deg;C & 55&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L6876-5G</td>
<td>125 mg in 1000 &mu;l TE</td>
</tr>
<tr>
<td>Microcon&reg; Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42410</td>
<td>50 bp cut off</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-374-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>77617-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>19133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP2539-100</td>
<td>10 &mu;g/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Safe Imager&trade; Blue light transilluminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S37102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>20% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterivex filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SVG010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Table top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5415D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE buffer, pH 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma&reg; base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge rotor, TLA 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>343847</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>343775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>348302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge, Optima&reg; Max</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna extraction from 0.22 &mu;m sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation

Denna metod används för att extrahera hög molekylvikt DNA vikt genomisk från planktoniska biomassa koncentreras på 0,22 mikroM Sterivex filter som har behandlats med förvaring / lyseringsbuffert och arkiveras vid -80 ° C, och att rena detta DNA med hjälp av en cesium gradient klorid densitet. Protokollet inleds med två en-timmes inkubation åtgärder för att frigöra DNA från celler och ta bort RNA. Nästa, en serie Fenol: är Kloroform och kloroform extrakt följt av centrifugering för att avlägsna proteiner och cell-komponenter membran, insamling av vattenfasen DNA-extrakt, och flera buffert steg utbyte för att tvätta och koncentrera extraktet. Femte delen beskriver valfria rening via cesiumklorid densitetsgradient. Det rekommenderas att arbeta med färre än 15 prover på en gång för att undvika förvirring och minska protokoll tid. Den totala tiden som krävs för detta protokoll beror på antalet prover som skall extraheras. För 10-15 prover och antar rätt centrifugeringen utrustningen är tillgänglig bör detta hela protokollet ta 3 dagar. Se till att du har hybridisering ugnar inställd temperatur i början av processen.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Extraction from 0.22 ÃŽÂ¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Vi beskriver en metod för utvinning av hög molekylvikt genomisk DNA från planktoniska biomassa koncentreras på 0,22 ìm Sterivex filter, följt av cesiumklorid densitetsgradient centrifugering för rening.

DNA-extraktion från 0,22 mikroM Sterivex Filter och cesiumklorid densitetsgradient Centrifugering

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Utvinning av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mark och sediment

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

DNA-extraktion från paraffininbäddad Material för genetiska och epigenetiska Analyser

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Utvinning av hög molekylvikt DNA från Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extraktion och analys av kortisol från Human och Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Den Infiltration-centrifuge Teknik för Utvinning av apoplastisk Vätska från växtblad Använda<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Som ett exempel

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

En hybrid-DNA Extraction Metod för kvalitativ och kvantitativ bedömning av bakteriella gemenskapernas från fjäderfäproduktion Prover

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyror: En enkel och snabb DNA-extraktion metod

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

Spermier samling av differentiell kvalitet med hjälp av täthet lutning centrifugering

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Ett magnetiskt pärlbaserat mygg-DNA-extraktionsprotokoll för nästa generations sekvensering

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Småskalig extraktion av Caenorhabditis elegans Genomiskt DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...