Name: preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures
Uploaded: 2009-06-08T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures at JoVE.com

Die Arbeit im Labor mit der Kultivierung von Aplysia ist nach Liste NIH R01 und NIH R21MH077921 finanziert.

Vorbereitung (siehe Lösungen Abschnitt am Ende des Protokolls für die Zusammensetzung von Lösungen) <ol><li> Bereiten Kulturschalen. Beschichtung von Glas und von Mattek Glasboden-Kulturschale mit Poly-L-Lysin (made in Natriumborat). Add genug, um vollständig zu bedecken das Glas gut und lassen für&gt; 1 Std. (über Nacht bleiben). Gründlich von Poly-L-Lysin durch Spülen in künstlichem Meerwasser (ASW) 4-5 mal. Nach dem Entfernen der letzten Spülgang, fügen Sie 2 ml 50% L15 (ergänzt mit Salzen und mit L-Glu...

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

Die erfolgreiche Herstellung von Aplysia sensomotorische Kulturen hat eine etwas langsame Lernkurve, da es die Entwicklung der Feinmotorik mit Mikrodissektion und Manipulation einzelner Nervenzellen über ein Stereo-Mikroskop betrachtet verbundenen beinhaltet. Nach unserer Erfahrung dauert es ca. 1-3 Wochen Praxis zu gesunden isolierten sensorischen Neuronen in Kultur und eine zusätzliche 1-3 Wochen erhalten zu lernen, wie sensorische Neuronen mit motorischen Neuronen Paar. Wir routinemäßig vorzubereiten Kul...

Lösungen benötigt für die Kultur <ol><li> 0,35 M MgCl 2, bei Raumtemperatur gelagert, verwendet für die Anästhesie. </li><li> Poly-L-Lysin-Lösung, Sigma: P-1524, MW&gt; 300.000, in 0,1 M Natrium-Borat pH8.2 bis 0,5-Promillegrenze Lösung gemacht. Vortex gut und filtriert durch ein 0,22 um Filter zu sterilisieren, lagern Sie es bei 4C °. Nicht Frost-Tau. </li><li> L-15 Medium-Pulver (Leibovitz) (Sigma: L4386) mit den Salzen, wie unten zu 1 Liter ergänzt <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L-15-Pulver </td><td> 13.8g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15,4 g </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> 6,24 g </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 170 mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 5,49 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> Add ddH20 auf 1 Liter. Der pH-Wert sollte ca. 7,4-7,5 werden, fügen Sie 10 ml 100X Pen / Strep-Lösung und durch einen 0,22 m Filter Filter-sterilisiert. Lagerung bei 4C0 nicht länger als 1 Monat. </li><li> Proteaseverdau Lösung: 1% Protease IX (1unit/mg) ist in L15 gemacht (ergänzt mit Salzen wie oben) oder in ASW unmittelbar vor dem Gebrauch, durch einen 0,22 m Millipore-Filter-sterilisiert. 5mls sollte genug für den Ganglien von zwei Tieren (sicherstellen, dass die Ganglien vollständig in Protease-Lösung getaucht). Sigma hat berichtet, dass sie einzustellen Verkauf Protease IX. Ein Ersatz-Protease ist: Dispase II (Roche Applied Science Katalog # 04942078001). </li><li> Kulturmedium. Unmittelbar vor der Vorbereitung Kulturen, Tauwetter ein 10 ml Aliquot Hämolymphe und mischen Sie es mit 10 ml L15 (ergänzt mit Salzen wie oben), um 20mls Kulturmedium zu machen. Add 200 ul 200 mM L-Glutamin, gut mischen und Verwendung zur Herstellung von Kulturen. Dieses Medium sollte frisch zubereitet jedes Mal Kulturen gemacht werden. </li><li> Künstlichem Meerwasser kann von Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) oder wie folgt vorgenommen werden: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl 2 (6H 2 O), 20 mM MgSO 4, 10 mM CaCl 2 (2H 2 O), 10 mM HEPES, mit pH-Wert eingestellt auf 7,4. </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

Das Nervensystem der Meeresschnecke Aplysia californica ist relativ einfach, bestehend aus etwa 20.000 Neuronen. Die Neuronen sind groß (bis zu 1 mm im Durchmesser) und identifizierbar sind, mit unterschiedlichen Größen, Formen, Positionen und Pigmentierungen, und die Zellkörper nach außen in fünf gepaart Ganglien im ganzen Körper des Tieres verteilt ausgesetzt. Diese Eigenschaften haben die Forscher um die Schaltung zugrunde liegenden spezifischen Verhaltensweisen in der Tier 1 abzugrenzen erlaubt. Die monosynaptische Verbindung zwischen sensorischen und motorischen Neuronen ist ein zentraler Bestandteil der Kiemenrückziehreflex in das Tier, eine einfache Abwehrreflex in dem das Tier zieht ihren Kiemen in Reaktion auf taktile Stimulation des Siphons. Dieser Reflex erfährt Formen des nicht-assoziativen und assoziativen Lernens, einschließlich der Sensibilisierung, Gewöhnung und klassische Konditionierung. Von besonderem Nutzen für das Studium der synaptischen Plastizität kann der sensorisch-motorischen Synapse in der Kultur wieder hergestellt werden, wo gut charakterisierten Reize zu entlocken Formen der Plastizität, die direkt korreliert in das Verhalten des Tieres 2,3 haben. Speziell erzeugt Anwendung von Serotonin eine synaptische Verstärkung, dass, abhängig von der Anwendung Protokoll, dauert Minuten (kurzfristige Erleichterung), Stunden (mittelfristige Erleichterung) oder Tagen (langfristige Erleichterung). Im Gegensatz dazu erzeugt die Anwendung der Peptid-Sender FMRFamid eine synaptische Schwächung oder Depression, die, abhängig von der Anwendung Protokoll von Minuten bis Tage (long-term depression) dauern kann. Die Größe der Neuronen ermöglicht wiederholte scharfe Elektrode Aufnahme der synaptischen Erregung über Zeiträume von Tagen zusammen mit Mikroinjektion von Expressionsvektoren, siRNAs und andere Verbindungen auf spezifische Signalwege und Moleküle Ziel und damit die molekularen und zellbiologischen Schritte, die Änderungen unterliegen in der synaptischen Effizienz. Ein weiterer Vorteil der Aplysia Kultur-System kommt von der Tatsache, dass die Neuronen Synapsen-Spezifität zeigen, in der Kultur 4,5. So müssen sensorischen Neuronen nicht bilden Synapsen mit sich selbst (autapses) oder mit anderen sensorischen Neuronen, noch bilden sie Synapsen mit Nicht-Zielorganismen identifiziert Motoneuronen in der Kultur. Die Krampfadern, Stätten der synaptischen Kontakte zwischen sensorischen und motorischen Neuronen, sind groß genug (2-7 Mikrometer im Durchmesser), damit Synapsenbildung (sowie Veränderungen der synaptischen Morphologie) mit Ziel-Motoneuronen auf das Licht mikroskopischer Ebene untersucht werden. In diesem Video zeigen wir jeden Schritt der Herstellung sensorisch-motorischen Neurons Kulturen, einschließlich Anästhesie erwachsenen und jugendlichen Aplysia, sezieren ihre Ganglien, Proteaseverdau der Ganglien, die Entfernung des Bindegewebes durch Mikrodissektion, Identifizierung der beiden sensorischen und motorischen Neuronen und Entfernung jeder Zelltyp durch Mikrodissektion, dem Plattieren der Motoneuronen, neben der sensorischen Neuronen und Manipulation der sensorischen Neuriten Kontakt mit dem kultivierten Motoneuronen bilden.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures at JoVE.com

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primäre Kulturen von<em&gt; Aplysia</em&gt; Senso-motorischen Neuronen ein Modell Vorbereitung auf das Studium Synapsenbildung und synaptische Plastizität<em&gt; In-vitro-</em&gt;. Dieses Video zeigt die Identifikation und Mikrodissektion der sensorischen und motorischen Neuronen aus<em&gt; Aplysia</em&gt; Ganglien sowie die Methoden zur Festlegung und Aufrechterhaltung senso-motorischen Neuronen in Kultur.

Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES-Zellen abgeleiteten neuroepithelialen Zellkulturen

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Forschung

Biologie

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronalen Zellkulturen von Aplysia für High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...