Name: preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures
Uploaded: 2009-06-08T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures at JoVE.com

Работа в лаборатории с участием культивирования Aplysia нейронов финансируется список НИЗ R01 и NIH R21MH077921.

Подготовка (см. раздел решения в конце протокола состав растворов) <ol><li> Подготовка культуры блюд. Пальто из стекла и Маттек со стеклянным дном культуры блюдо с поли-L-лизин (пр-во борат натрия). Добавьте достаточно, чтобы полностью покрыть стекло хорошо и оставить на&gt; 1 час (можно остави...

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

Успешной подготовки Aplysia сенсомоторной культуры имеет несколько медленно обучения, так как она включает в себя развитие мелкой моторики связано с микродиссекции и манипулирование отдельными нейронами рассматривается через стерео-микроскопа. По нашему опыту, это занимает около 1...

Решения необходимо для культуры <ol><li> 0,35 M MgCl 2, хранить при комнатной температуре, используемый для анестезии. </li><li> Поли-L-лизин решение, Sigma: P-1524, МВт&gt; 300000, выполненный в 0,1 М натрий Борат pH8.2 к 0.5mg/ml решение. Vortex хорошо и стерилизовать через фильтр 0,22 мкм фильтр, храните его в 4C °. Не замораживания-оттаивания. </li><li> L-15 Средний порошок (Лейбовиц) (Sigma: L4386) с добавлением соли, как показано ниже, чтобы сделать 1 литр <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L-15 порошок </td><td> 13.8g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15,4 г </td></tr><tr><td> D-глюкозы </td><td> 6,24 г </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 мг </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 170 мг </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 5,49 г </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> Добавить ddH20 до 1 л. РН должен быть около 7,4-7,5, добавляют 10 мл 100X Pen / Strep решение, и фильтр-стерилизовать через фильтр 0,22 м. Хранить при 4C0 не более чем на 1 месяц. </li><li> Протеазы пищеварения решение: 1% протеазы IX (1unit/mg) производится в L15 (дополнено солей, что и выше) или в ASW непосредственно перед употреблением, фильтр-стерилизовать через 0,22 м Millipore. 5mls должно быть достаточно для ганглиев из двух животных (убедитесь, что ганглии полностью погружены в раствор протеазы). Sigma сообщила, что они будут прекратить продажу протеазы IX. Заменить протеаз: Dispase II (Roche Applied Science Каталог # 04942078001). </li><li> Культуральной среде. Непосредственно перед подготовкой культур, оттепель 10 мл аликвоту гемолимфы и смешайте его с 10 мл L15 (дополнено солей, что и выше), чтобы сделать 20mls питательной среды. Добавить 200 мкл 200 мМ L-глутамина, хорошо перемешать и использовать для подготовки культур. Эта среда должна быть готова каждый раз свежее культур выполнены. </li><li> Искусственной морской воде могут быть сделаны из мгновенных океана (аквариум Systems, Mentor, OH) или следующим образом: 450 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 30 мМ MgCl 2 (6H 2 O), 20 мМ MgSO 4, 10 мМ CaCl 2 (2H 2 O), 10 мМ HEPES, с рН до 7,4. </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures at JoVE.com

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Первичные культуры<em&gt; Aplysia</em&gt; Сенсорно-моторные нейроны обеспечивают модели подготовки для изучения образование синапсов и синаптической пластичности<em&gt; В пробирке</em&gt;. Это видео демонстрирует идентификации и микродиссекции сенсорных и моторных нейронов из<em&gt; Aplysia</em&gt; Ганглиях, а также методы создания и поддержания сенсорно-моторных нейронов в культуре.

Подготовка Aplysia Сенсомоторной нейронов клеточных культур

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Первичные культуры нейронов из мозга дрозофилы поздней стадии куколки

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Подготовка диссоциированных Мышь корковых культур Нейрон

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Нейронные клеточные культуры из Aplysia для изображений с высоким разрешением роста конусов

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Мышь эпидермального нервного гребня стволовых клеток (EPI-NCSC) Культур

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Получение 2-dGuo обработанных Thymus культур Органный

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Подготовка и обслуживание Спинной корневой Ganglia Нейроны в отсеки культур

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Подготовка мозга крысы Совокупный культур для Нейрон и исследований Глия развития

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...