Name: preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures
Uploaded: 2009-06-08T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures at JoVE.com

Trabajar en el laboratorio implican el cultivo de neuronas de Aplysia es financiado por el NIH lista R01 y R21MH077921 NIH.

Preparación (véase la sección de soluciones al final del protocolo para la composición de las soluciones) <ol><li> Preparar platos de cultivo. Capa de vidrio y de la cultura plato Mattek con fondo de vidrio con poli-L-lisina (hecho en borato de sodio). Añade suficiente para cubrir completamente el vidrio bien y dejar de&gt; 1 hora (se puede dejar toda la noche). Bien eliminar el ácido poli-L-lisina mediante lavado en agua de mar artificial (ASW) 4-5 veces. Después de quitar el último enjuague, agregar 2 ml de ...

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

La preparación exitosa de Aplysia sensorio-motor culturas tiene una curva de aprendizaje un poco lento, ya que implica el desarrollo de las habilidades motoras finas relacionadas con microdisección y la manipulación de las neuronas individuales han visto a través de un microscopio estereoscópico. En nuestra experiencia, lleva semanas aproximadamente 1-3 de la práctica para obtener saludable neuronas sensoriales aisladas en la cultura y un adicional de 1-3 semanas para aprender a par de las neuronas sensor...

Soluciones necesarias para la cultura <ol><li> 0,35 M MgCl 2, almacenado a temperatura ambiente, utilizado para la anestesia. </li><li> Poli-L-lisina solución, Sigma: P-1524, MW&gt; 300 000, realizado en borato de sodio 0,1 M pH8.2 a 0.5mg/ml solución. Vortex bien y filtrar esterilizar a través de un filtro de 0,22 micras, que tienda a ° 4C. No congelar y descongelar. </li><li> Medio L-15 en polvo (Leibovitz) (Sigma: L4386), complementado con las sales de la siguiente manera para obtener 1 litro <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L-15 en polvo </td><td> 13,8 g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15,4 g </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> 6,24 g </td></tr><tr><td> 7H MgSO 4 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 170 mg </td></tr><tr><td> MgCl2 6H 2 O </td><td> 5,49 g </td></tr><tr><td> CaCl2 2H 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> Añadir ddH20 a 1 litro. El pH debe ser de 7.4-7.5, agregar 10 ml de 100X penicilina / estreptomicina solución, y el filtro a esterilizar a través de un filtro de 0,22 m. Tienda en 4C0 por no más de 1 mes. </li><li> Solución de proteasa digestión: 1% de la proteasa IX (1unit/mg) se realiza en L15 (junto con las sales que el anterior) o en ASW inmediatamente antes de su uso, esterilizada por filtración a través de un Millipore 0,22 m. 5mls debería ser suficiente para los ganglios de dos animales (asegúrese de que los ganglios están completamente sumergidos en la solución de la proteasa). Sigma ha informado que dejará de vender la proteasa IX. Un sustituto de la proteasa: Dispasa II (Roche Applied catálogo Ciencia # 04942078001). </li><li> Medio de cultivo. Inmediatamente antes de la preparación de las culturas, descongelar una alícuota de 10 ml de hemolinfa y se mezcla con 10 ml de L15 (junto con las sales que el anterior) para que medio de cultivo 20mls. Añadir 200 l de 200 mM L-Glutamina, mezclar bien y utilizar para la preparación de las culturas. Este medio debe estar recién culturas cada vez que se realicen. </li><li> El agua de mar artificial se puede hacer de inmediato Océano (Sistemas de Acuario, Mentor, OH) o de la siguiente manera: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl 2 (6H 2 O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl 2 (2H 2 O), HEPES 10 mM, con pH ajustado a 7,4. </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

El sistema nervioso del molusco marino Aplysia californica es relativamente simple, que consiste en aproximadamente 20.000 neuronas. Las neuronas son grandes (hasta 1 mm de diámetro) e identificable, con distintos tamaños, formas, posiciones y pigmentaciones, y los cuerpos de las células son expuestas externamente en los ganglios pares cinco marcas distribuidas por todo el cuerpo del animal. Estas propiedades han permitido a los investigadores para delimitar los circuitos subyacentes comportamientos específicos en los animales 1. La conexión entre monosináptica neuronas sensoriales y motoras es un componente central del reflejo de enmalle a la retirada del animal, un simple reflejo defensivo en el que el animal se retira de su enmalle en respuesta a la estimulación táctil del sifón. Este reflejo se somete a las formas de aprendizaje no asociativo y asociativo, incluyendo la sensibilización, la habituación y condicionamiento clásico. De beneficio particular para el estudio de la plasticidad sináptica, las sinapsis sensorio-motor puede ser reconstituida en la cultura, donde bien caracterizados estímulos provocan las formas de plasticidad que tienen correlatos directos en el comportamiento de los animales 2,3. Específicamente, la aplicación de la serotonina produce un reforzamiento sináptico que, según el protocolo de aplicación, tiene una duración de minutos (a corto plazo de facilitación), horas (a medio plazo de facilitación) o días (facilitación de largo plazo). Por el contrario, la aplicación de la FMRFamide transmisor péptido produce un debilitamiento o la depresión sináptica que, según el protocolo de aplicación, pueden durar desde minutos a días (depresión a largo plazo). El gran tamaño de las neuronas permite la grabación repetidas electrodo afilado de la fuerza sináptica durante períodos de días, junto con la microinyección de vectores de expresión, siRNAs y otros compuestos específicos de cascadas de señalización y de las moléculas y así identificar los pasos de biología molecular y celular que subyacen a los cambios en la eficacia sináptica. Una ventaja adicional del sistema de cultivo Aplysia viene del hecho de que las neuronas sinapsis demostrar la especificidad de la cultura en 4,5. Así, las neuronas sensoriales no forman sinapsis con ellos mismos (autapses) o con otras neuronas sensoriales, ni forman sinapsis con las neuronas no son objeto de automotor identificado en la cultura. Las varices, los sitios de contacto sináptico entre las neuronas sensoriales y motoras, son lo suficientemente grandes (2-7 micras de diámetro) para permitir la formación de sinapsis (así como cambios en la morfología sináptica) con las neuronas motoras de destino para ser estudiado a nivel microscópico de luz. En este vídeo, que muestran cada paso de la preparación de sensorio-motor cultivos de neuronas, incluyendo adultos y anestesiar Aplysia juvenil, la disección de sus ganglios, la digestión de la proteasa de los ganglios, la eliminación del tejido conjuntivo por microdisección, la identificación de dos neuronas sensoriales y motoras y la eliminación de cada tipo celular por microdisección, revestimiento de la neurona motora, además de la neurona sensorial y la manipulación de las neuritas sensorial para formar el contacto con el cultivo de neuronas motoras.

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Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Cultivos primarios de<em&gt; Aplysia</em&gt; Sensorio-motor neuronas proporcionar una preparación de modelos para el estudio de la formación de sinapsis y la plasticidad sináptica<em&gt; In vitro</em&gt;. Este video muestra la identificación y microdisección de las neuronas sensoriales y motoras de<em&gt; Aplysia</em&gt; Ganglios, así como los métodos para establecer y mantener sensorio-motor neuronas en cultivo.

Preparación de Aplysia Sensorio-motor culturas de células neuronales

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

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ES células derivadas de células de las Culturas neuroepiteliales

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Investigación

Biología

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This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

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Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento

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