Name: preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures
Uploaded: 2009-06-08T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures at JoVE.com

Arbetet i labbet som omfattar odling av Aplysia nervceller finansieras av listan NIH R01 och NIH R21MH077921.

Beredning (se lösningar avsnitt i slutet av protokoll för sammansättning av lösningar) <ol><li> Förbered kultur rätter. Coat glas väl av Mattek glasbottnade kultur fat med poly-L-lysin (görs i natriumborat). Lägg tillräckligt för att helt täcka glaset väl och låt stå i&gt; 1 timme (kan lämnas över natten). Noggrant bort poly-L-lysin genom att skölja i konstgjorda havsvatten (ASW) 4-5 gånger. Efter att den sista sköljningen, tillsätt 2 ml av 50% L15 (kompletteras med salter och som innehåller L-gl...

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

I utarbetandet av ett Aplysia sensomotorisk kulturer har en något långsam inlärningskurva, eftersom det innebär utveckling av finmotorik förknippade med microdissection och manipulation av enskilda nervceller betraktas genom ett stereomikroskop. Enligt vår erfarenhet tar det ca 1-3 veckors praktik för att få friska isolerade sensoriska neuroner i kultur och ytterligare 1-3 veckor att lära sig att para sensoriska nervceller med motoriska nervceller. Vi förbereder rutinmässigt kulturer i en Labconco st...

Lösningar som behövs för kulturen <ol><li> 0,35 M MgCl 2, förvaras i rumstemperatur, som används för anestesi. </li><li> Poly-L-lysin lösning, Sigma: P-1524, MW&gt; 300 tusen, tillverkad i 0,1 miljoner natriumborat pH8.2 till 0.5mg/ml lösning. Vortex väl och filtrera sterilisera genom ett 0,22 ìm filter, lagra den på 4C °. Får ej frysas-tina. </li><li> L-15 Medium pulver (Leibovitz) (Sigma: L4386) kompletteras med salter som nedan för att göra 1 liter <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L-15 pulver </td><td> 13.8g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15,4 g </td></tr><tr><td> D-Glukos </td><td> 6,24 g </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 170 mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 5,49 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> Lägg ddH20 till 1 liter. PH-värdet bör vara ca 7,4-7,5, tillsätt 10 ml 100X Penna / Strep lösning och filter-sterilisera genom ett 0,22 m filter. Förvaras vid 4C0 inte längre än 1 månad. </li><li> Proteas matsmältning lösning: 1% Protease IX (1unit/mg) görs i L15 (kompletteras med salter som ovan) eller i ASW omedelbart före användning, filter-steriliseras genom ett 0,22 m Millipore. 5mls bör räcka för de ganglierna från två djur (se till att ganglierna är fullständigt nedsänkt i proteas lösning). Sigma har rapporterat att de kommer att sluta sälja Protease IX. Ett substitut proteas är: Dispase II (Roche Applied Science katalog # 04942078001). </li><li> Odlingsmedium. Omedelbart före förbereda kulturer, tina en 10 ml alikvot av hemolymph och blanda det med 10 ml av L15 (kompletteras med salter som ovan) att göra 20mls odlingsmedium. Tillsätt 200 ìl 200mm L-glutamin, blanda väl och använd för att förbereda kulturer. Detta medium bör beredas på nytt varje gång kulturer görs. </li><li> Konstgjord Havsvatten kan göras från Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) eller enligt följande: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl 2 (6H 2 O), 20 mm MgSO 4, 10 mm CaCl 2 (2H 2 O), 10 mm HEPES, med pH justeras till 7,4. </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

Nervsystemet av den marina mollusk Aplysia californica är relativt enkel och består av cirka 20.000 nervceller. Nervceller är stora (upp till 1 mm i diameter) och identifierbara, med tydliga storlekar, former, positioner och pigmenteringar, och cellen kroppar är externt exponerade i fem parade ganglier distribueras i hela kroppen av djuret. Dessa egenskaper har gjort utredare för att avgränsa kretsen underliggande specifika beteenden i djuret 1. Den monosynaptic sambandet mellan sensoriska och motoriska nervceller är en central del av gäl-tillbakadragande reflex hos djuret, en enkel defensiv reflex där djuret drar tillbaka sitt bottengarn som svar på taktil stimulering av sifon. Denna reflex genomgår former av icke-associativa och associativa inlärning, inklusive sensibilisering, tillvänjning och klassisk betingning. Av särskild nytta för studier av synaptisk plasticitet, kan sensomotorisk synaps beredas i kultur, där välkarakteriserad stimuli framkallar former av plasticitet som har direkt korrelerar i djurets beteende 2,3. Specifikt producerar tillämpning av serotonin en synaptisk förstärkning som, beroende på Application Protocol, varar i minuter (på kort sikt underlätta), timmar (mellanliggande sikt underlätta) eller dagar (lång sikt underlätta). Däremot producerar tillämpning av peptiden sändaren FMRFamide en synaptisk försvagning eller depression som, beroende på applikation protokollet kan pågå från minuter till dagar (långvarig depression). Den stora storleken på nervceller möjliggör upprepade skarpa elektrod inspelning av synaptisk styrka under perioder av dagar tillsammans med mikroinjektion av expressionsvektorer, siRNA och andra föreningar för att inrikta sig på särskilda signalering kaskader och molekyler och därigenom identifiera de molekylära och cellbiologiska steg som ligger bakom de förändringar i synaptisk effekt. En ytterligare fördel med Aplysia kultur-systemet kommer från det faktum att de nervceller visar synapsen-specificitet i kulturen 4,5. Således utgör sensoriska neuron inte synapser med sig själva (autapses) eller med andra sensoriska nervceller, inte heller bildar synapser med icke-målorganismer identifierade motoriska nervceller i kultur. Den varicosities, platser av synaptiska kontakter mellan sensoriska och motoriska nervceller, är tillräckligt stora (2-7 mikrometer i diameter) så att synapserna bildas (samt förändringar i synaptiska morfologi) med nervceller målet motor som skall undersökas i ljuset mikroskopisk nivå. I denna video visar vi varje steg för att förbereda sensomotorisk neuron kulturer, inklusive anesthetizing vuxna och unga Aplysia, dissekera deras ganglier, proteas nedbrytning av ganglier, borttagning av bindväv med microdissection, identifiering av både sensoriska och motoriska nervceller och borttagning av varje celltyp som microdissection till plätering av motorn neuron, tillägg av sensoriska neuron och manipulation av sensoriska neurite formen kontakt med den odlade motoriska neuron.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures at JoVE.com

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primär kulturer<em&gt; Aplysia</em&gt; Sensoriska-motoriska nervceller skapa en modell förberedelse för att studera synaps bildning och synaptisk plasticitet<em&gt; In vitro</em&gt;. Denna video visar identifiering och microdissection av sensoriska och motoriska nervceller från<em&gt; Aplysia</em&gt; Ganglierna samt metoder för att etablera och upprätthålla sensoriska-motoriska nervceller i kultur.

Beredning av Aplysia Sensomotorisk Neuronal cellkulturer

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES-cellerna neuroepiteliala cellkulturer

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Primär Neuronal kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Beredning av Neuronal kulturer från Midgastrula Stage Drosophila embryon

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Beredning av dissocierade Mouse kortikala Neuron kulturer

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal cellkulturer från Aplysia för högupplöst avbildning av tillväxt Kottar

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Mus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) kulturer

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Beredning av 2-dGuo-behandlade Thymus Organ kulturer

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Upprättande och underhåll av ryggfenan Nervceller rotganglier i Fackindelade kulturer

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Beredning av Aggregate råtthjärna kulturer för Neuron och Glia utvecklingsstudier

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...