Name: microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00
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Dieses Protokoll wird derzeit in unserem Labor eingesetzt und hat im Laufe der Jahre von vielen Menschen, darunter Dr. David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur verfeinert. Wir danken Dr. Bill Sullivan (UCSC), die uns mit ausgezeichneten Beratung auf die Manipulation und Mikroinjektion der frühen Drosophila-Embryonen, wenn unsere Arbeit in diesem System, das initiiert wurde (Code 13). Wir danken allen Mitgliedern des Scholey Labor. Unsere Arbeit auf die Mitose in Drosophila wird durch NIH GM55507 unterstützt.

Rezepte: Grape Juice Platten: <ul><li> 5.5g Bacto-Agar </li><li> 14,5 g Dextrose oder Glucose </li><li> 7,15 g Saccharose </li><li> 45 ml Traubensaft-Konzentrat (100% Saft). </li><li> 204,5 ml H 2 0 </li><li> 625 ul 10N NaOH </li></ul> Alle Zutaten mischen und eine Mikrowelle zum Kochen bringen. Fügen Sie 2,8 ml saure Mischung (Säure-Mix: 20,9 ml Propionsäure, 2,1 ml Phosphorsäure, 27 ml H 2 0) Mix und gieß...

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	<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila.">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos.">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li><li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis.">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li><li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+anaphase+B:+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation.">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos.">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li><li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states.">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li><li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch:+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient.">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromokinesin,+KLP3A,+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility.">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos.">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+kinesin,+KLP61F,+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles.">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li><li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos.">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy,+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li></ol>

Dieses Protokoll ist relativ einfach, aber jeder Schritt der Praxis erfordert, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht beschädigt werden. Sorgfältige Kontrolle Experimente brauchen immer zu tun, um sicherzustellen, dass zuverlässige Ergebnisse zu erhalten werden. Ein guter Weg, dies zu beginnen, ist durch Mikroinjektion Puffer oder Rhodamin Tubulin zu kontrollieren Embryonen, die GFP-Tubulin, um sicherzustellen, dass die Mitose in der Regel durchläuft alle Zyklen bei dem Embryo Oberfläche (Zyklen 10 bis 13). I...

microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des Drosophila melanogaster-Syncytial-Embryo für das Studium der Mitose 1. Drosophila hat nützliche Genetik mit einem sequenzierten Genoms, und es kann leicht zu pflegen und manipuliert werden. Viele mitotischen Mutanten existieren, und transgenen Fliegen zum Ausdruck funktionaler fluoreszierend (zB GFP) - getaggt mitotischen Proteine ​​wurden und werden generiert. Gezielte Genexpression ist möglich mit dem GAL4/UAS System 2. Die Drosophila frühen Embryo führt mehrere Mitosen sehr schnell (Zellzyklus Dauer ≈ 10 min). Es ist gut für die Bildgebung der Mitose geeignet, da während der Zyklen 10-13, Kerne teilen sich rasch und synchron ohne einzugreifen Zytokinese an der Oberfläche des Embryos in einem einzigen Monoschicht knapp unterhalb der Hirnrinde. Diese sich schnell teilenden Kerne wahrscheinlich die gleichen mitotischen Maschinen wie andere Zellen, aber sie sind auf Geschwindigkeit optimiert; Kontrollpunkt wird allgemein angenommen, um nicht stringent, so dass das Studium der mitotischen Proteine, deren Fehlen würde Zellzyklusarrest in Zellen mit einem starken Checkpoint Ursache . Embryonen, die GFP-markierten Proteinen oder mikroinjiziert mit fluoreszenzmarkierten Proteine ​​können leicht abgebildet werden, um Live-Dynamik (Abb. 1) zu folgen. Darüber hinaus können Embryonen mit Funktions-blockierende Antikörper oder Inhibitoren von spezifischen Proteinen, um den Effekt des Verlustes oder der Störung ihrer Funktion 3-Studie mikroinjiziert werden. Diese Reagenzien können in den Embryo diffuse und erreichte viele Spindeln zu einem Gradienten der Konzentration des Inhibitors, was wiederum in einer Steigung von Mängeln vergleichbar mit einer allelischen Serie von Mutanten. Produzieren Im Idealfall, wenn das Zielprotein fluoreszierend markiert ist, kann die Steigung der Hemmung direkt dargestellt werden 4. Es wird davon ausgegangen, dass die stärksten Phänotyp vergleichbar mit der null-Phänotyp ist, obwohl es schwer ist, formal die Möglichkeit ausschließen, dass die Antikörper können dominanten Effekte in seltenen Fällen so strenge Kontrollen und eine vorsichtige Interpretation haben muss angewendet werden. Weiter entfernt von der Injektionsstelle ist Protein Funktion nur teilweise verloren damit andere Funktionen des Zielproteins sichtbar zu machen.

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Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikroinjektion und hochauflösende Bildgebung in der<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Syncytial Embryo Mitose studieren.

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

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