Name: microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo at JoVE.com

פרוטוקול זה משמש כיום במעבדה שלנו שוכללה במרוצת השנים על ידי אנשים רבים, כולל בני הזוג דוד שארפ, Mijung קוון, פטריציה Sommi, Dhanya Cheerambathur. אנו מודים ד&quot;ר ביל סאליבן (UCSC), אשר סיפק לנו עצה מצוינת על מניפולציה ו microinjection מוקדם של עוברים תסיסנית כאשר עבודתנו במערכת זו היה להיות יזם (ref. 13). אנו מודים לכל חברי המעבדה Scholey. העבודה שלנו על מיטוזה ב תסיסנית נתמך על ידי NIH מענק GM55507.

מתכונים: מיץ ענבים צלחות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.5g אגר bacto </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 14.5 גרם גלוקוז או דקסטרוז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7.15 גרם סוכרוז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 45 מ&quot;ל מיץ ענבים להתרכז...

<ol>
	<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila.">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos.">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li><li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis.">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li><li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+anaphase+B:+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation.">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos.">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li><li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states.">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li><li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch:+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient.">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromokinesin,+KLP3A,+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility.">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos.">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+kinesin,+KLP61F,+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles.">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li><li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos.">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy,+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li></ol>

פרוטוקול זה היא פשוטה יחסית, עם זאת, כל צעד דורשת תרגול כדי לוודא את העוברים שאינם פגומים. ניסויים בקרה קפדנית תמיד צריך להיעשות כדי להבטיח תוצאות אמינות עוברים שהושגו. דרך טובה להתחיל זאת היא על ידי microinjecting טובולין חיץ או rhodamine לעוברי לשלוט בהבעת GFP-טובולין לוודא כי מ?...

microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של העובר תסיסנית melanogaster סינסיציאלי ללימוד מיטוזה 1. תסיסנית יש גנטיקה שימושי עם רצף הגנום, וזה יכול להישמר בקלות מניפולציות. מוטנטים mitotic רבים קיימים, וזבובים מהונדס המבטא פונקציונלי fluorescently (GFP למשל) - חלבונים mitotic מתויג כבר והם שנוצר. ביטוי גנים ממוקד אפשרי באמצעות מערכת GAL4/UAS 2. העובר תסיסנית מוקדם מבצעת mitoses מרובים במהירות רבה (משך מחזור התא, ≈ 10 דקות). זה גם מתאים הדמיה מיטוזה, כי במהלך מחזורי 10-13, גרעינים לחלק במהירות סינכרוני בלי להתערב cytokinesis על פני השטח של העובר בשכבה יחידה רק מתחת לקליפת המוח. גרעינים אלה במהירות לחלק מן הסתם להשתמש במכונות mitotic כמו תאים אחרים, אבל הם אופטימיזציה עבור מהירות, המחסום הוא האמין בדרך כלל לא להיות מחמירים, המאפשרים לימוד של חלבונים mitotic שחסרונו יגרום מחזור התא בתאי מעצר עם מחסום חזק . עוברים לבטא חלבונים GFP שכותרתו או microinjected עם חלבונים שכותרתו fluorescently ניתן הדמיה בקלות לעקוב אחר הדינמיקה חיים (איור 1). בנוסף, עוברים ניתן microinjected עם פונקציית חסימת נוגדנים או מעכבי חלבונים ספציפיים כדי לחקור את ההשפעה של אובדן או ההפרעות בתפקוד שלהם 3. ריאגנטים אלה יכולים לפזר לאורך העובר, והגיע spindles רבים לייצר שיפוע של ריכוז מעכב, אשר בתוצאות פונים שיפוע של ליקויים דומים סדרה allelic של מוטציות. באופן אידיאלי, אם חלבון המטרה היא שכותרתו fluorescently, שיפוע של עיכוב ניתן דמיינו ישירות 4. ההנחה היא כי הפנוטיפ החזקים ניתן להשוות פנוטיפ ריק, אם כי קשה רשמית לשלול את האפשרות כי הנוגדנים יש תופעות הדומיננטי במקרים נדירים, בקרות מחמירות כל כך פרשנות זהירה חייב להיות מיושם. הרחק הזריקה, תפקוד החלבון הוא רק איבד חלקית ומאפשר פונקציות אחרות של חלבון המטרה להיות ברור.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo at JoVE.com

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; העובר סינסיציאלי ללמוד מיטוזה.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

לימוד תוקפנות תסיסנית (זבובי פירות)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב<em&gt; תסיסנית</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...