Name: microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo at JoVE.com

Questo protocollo è attualmente utilizzato nel nostro laboratorio ed è stato affinato negli anni da molte persone tra dottori David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur. Ringraziamo il dottor Bill Sullivan (UCSC), che ci ha fornito ottimi consigli sulla manipolazione e la microiniezione di primi embrioni di Drosophila quando il nostro lavoro in questo sistema era in fase di avvio (rif. 13). Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Scholey. Il nostro lavoro sulla mitosi in Drosophila è sostenuto da NIH concedere GM55507.

Ricette: Succo d&#39;uva piastre: <ul><li> 5.5g bacto agar </li><li> 14,5 g destrosio o glucosio </li><li> 7,15 g di saccarosio </li><li> 45 ml di succo concentrato d&#39;uva (100% di succo). </li><li> 204,5 ml di H 2 0 </li><li> 625 microlitri 10N NaOH </li></ul> Mescolare tutti gli ingredienti e forno a microonde fino a ebollizione. Aggiungere 2,8 ml di acido mix (mix di acido: 20,9 ml di acido propionico, acido fosforico 2,1 ml, 27 ml di H 2</...

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	<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila.">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos.">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li><li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis.">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li><li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+anaphase+B:+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation.">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos.">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li><li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states.">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li><li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch:+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient.">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromokinesin,+KLP3A,+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility.">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos.">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+kinesin,+KLP61F,+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles.">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li><li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos.">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy,+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li></ol>

Questo protocollo è relativamente semplice, tuttavia, ogni passo richiede pratica per assicurarsi che gli embrioni non siano danneggiati. Esperimenti di controllo attento sempre bisogno di essere fatto per garantire che i risultati affidabili si stanno ottenendo. Un buon modo per cominciare questo è microinjecting tubulina buffer o rodamina in embrioni di controllo che esprime GFP-tubulina per assicurarsi che la mitosi procede normalmente attraverso tutti i cicli in superficie dell&#39;embrione (cicli da 10 a 13). Neg...

microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo

Questo protocollo descrive l&#39;uso di embrioni di Drosophila melanogaster sinciziale per lo studio mitosi 1. Drosophila è genetica utile con un genoma sequenziato, e può essere facilmente gestito e manipolato. Mutanti mitotici esistono molte, e vola transgenici che esprimono funzionale fluorescente (es. GFP) - proteine ​​mitotico tag sono stati e vengono generati. Espressione genica mirata è possibile con il sistema GAL4/UAS 2. L&#39;embrione di Drosophila primi svolge mitosi multipli molto rapidamente (durata del ciclo cellulare, ≈ 10 min). E &#39;adatto per l&#39;imaging mitosi, perché durante i cicli di 10-13, i nuclei si dividono rapidamente e in modo sincrono senza intervenire citocinesi sulla superficie dell&#39;embrione in un monostrato singolo appena sotto la corteccia. Questi nuclei si dividono rapidamente probabilmente usare gli stessi macchinari mitotico come le altre cellule, ma sono ottimizzate per la velocità, il checkpoint è generalmente ritenuto di non essere rigorosi, permettendo lo studio delle proteine ​​mitotico la cui assenza avrebbe causato l&#39;arresto del ciclo cellulare in cellule con un posto di blocco forte . Gli embrioni che esprimono proteine ​​GFP etichettati o microiniettati con le proteine ​​fluorescente può essere facilmente ripreso a seguire le dinamiche vivere (Fig. 1). Inoltre, gli embrioni possono essere microiniettati con funzione di blocco anticorpi o inibitori di proteine ​​specifiche per studiare l&#39;effetto della perdita o di perturbazione della loro funzione 3. Questi reagenti possono diffondere in tutto l&#39;embrione, raggiungendo molti fusi per produrre un gradiente di concentrazione di inibitore, che a sua volta in un gradiente di difetti paragonabile ad una serie alleliche di mutanti. Idealmente, se la proteina bersaglio è fluorescente, il gradiente di inibizione può essere direttamente visualizzato 4. Si presume che il più forte fenotipo è paragonabile al fenotipo nullo, anche se è difficile escludere formalmente la possibilità che gli anticorpi possono avere effetti dominante in rari casi, i controlli in modo rigoroso e cauta interpretazione deve essere applicata. Più lontano dal sito di iniezione, la funzione delle proteine ​​è solo parzialmente perso permettendo altre funzioni della proteina bersaglio a diventare evidente.

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Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Questo protocollo descrive l&#39;uso di microiniezione e di imaging ad alta risoluzione nel<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Embrione sinciziale per studiare la mitosi.

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

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Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

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