Name: microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo at JoVE.com

Este protocolo é usado atualmente em nosso laboratório e tem sido aperfeiçoado ao longo dos anos por muitas pessoas, incluindo os Drs. David Sharp, Kwon Mijung, Sommi Patrizia, Cheerambathur dhanya. Agradecemos a Dr Bill Sullivan (UCSC), que nos forneceu excelentes conselhos sobre a manipulação e microinjeção de embriões Drosophila quando o nosso trabalho neste sistema estava sendo iniciada (ref. 13). Agradecemos a todos os membros do laboratório Scholey. Nosso trabalho sobre mitose em Drosophila é suportado pelo NIH conceder GM55507.

Receitas: Suco de uva placas: <ul><li> 5,5 g de ágar Bacto </li><li> 14,5 g de dextrose ou glicose </li><li> 7,15 g de sacarose </li><li> 45 ml suco concentrado de uva (100% suco). </li><li> 204,5 ml H 2 0 </li><li> 625 mL de NaOH 10N </li></ul> Misture todos os ingredientes e microondas até ferver. Adicionar 2,8 ml de ácido mix (mistura de ácido: 20,9 ml de ácido propiônico, ácido fosfórico 2,1 ml, 27 ml H 2 0) <p class="jove_c...

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	<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila.">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos.">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li><li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis.">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li><li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+anaphase+B:+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation.">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos.">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li><li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states.">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li><li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch:+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient.">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromokinesin,+KLP3A,+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility.">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos.">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+kinesin,+KLP61F,+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles.">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li><li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos.">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy,+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li></ol>

Este protocolo é relativamente simples, no entanto, cada etapa requer prática para se certificar de que os embriões não estão danificados. Experimentos de controle cuidadoso sempre precisa ser feito para garantir que os resultados estão sendo obtidos confiável. Uma boa maneira de começar isso é microinjecting tubulina buffer ou rodamina em embriões de controle expressando GFP-tubulina para se certificar de que a mitose prossegue normalmente através de todos os ciclos na superfície do embrião (ciclos de 10 a...

microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo

Este protocolo descreve o uso do embrião Drosophila melanogaster sincicial para estudar a mitose 1. Drosophila tem uma genética útil com um genoma sequenciado, e pode ser facilmente mantido e manipulado. Mutantes mitose existem muitas, e as moscas transgênicas expressando funcional fluorescente (GFP, por exemplo) - proteínas mitótica tagged foram e estão sendo gerados. Expressão do gene alvo é possível utilizar o sistema GAL4/UAS 2. O embrião Drosophila cedo realiza múltiplas mitoses muito rapidamente (duração do ciclo celular, ≈ 10 min). É bem adequado para imagens de mitose, pois durante os ciclos de 10-13, os núcleos se dividem rapidamente e de forma síncrona sem intervir citocinese na superfície do embrião em uma monocamada única logo abaixo do córtex. Esses núcleos se dividem rapidamente, provavelmente, usar o aparelho mitótico mesmo que outras células, mas eles são otimizados para a velocidade, o ponto de verificação é acreditado geralmente para não ser rigoroso, permitindo o estudo de proteínas mitótica cuja ausência poderia causar parada do ciclo celular em células com um posto de controle forte . Embriões que expressam proteínas GFP rotulados quanto com microinjeção de proteínas fluorescentes rotulados podem ser facilmente visualizados para acompanhar a dinâmica ao vivo (Fig. 1). Além disso, os embriões podem ser microinjeção com função de bloqueio de anticorpos ou inibidores de proteínas específicas para estudar o efeito da perda ou perturbação da sua função 3. Estes reagentes podem se propagar por todo o embrião, atingindo muitos fusos para produzir um gradiente de concentração de inibidor, o que resulta em um gradiente de defeitos comparável a uma série alélica de mutantes. Idealmente, se a proteína-alvo é fluorescente etiquetado, o gradiente de inibição pode ser diretamente visualizada 4. Supõe-se que o mais forte fenótipo é comparável ao fenótipo nulo, embora seja difícil formalmente excluir a possibilidade de que os anticorpos podem ter efeitos dominante em casos raros, os controles de modo rigoroso e interpretação cautelosa deve ser aplicado. Mais longe do local da injeção, a função da proteína é apenas parcialmente perdido permitindo que outras funções da proteína-alvo para se tornar evidente.

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Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Este protocolo descreve o uso de microinjeção e imagens de alta resolução na<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sincicial embrião para estudar a mitose.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

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Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

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Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

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Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

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Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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