Name: microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo at JoVE.com

Este protocolo se utiliza actualmente en nuestro laboratorio y ha sido perfeccionado a lo largo de los años por muchas personas como los doctores David Sharp, Kwon Mijung, Sommi Patrizia, Cheerambathur Dhanya. Se agradece al Dr. Bill Sullivan (UCSC), que nos ha proporcionado excelentes consejos sobre la manipulación y la microinyección de los primeros embriones de Drosophila, cuando nuestro trabajo en este sistema se está iniciando (ref. 13). Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Scholey. Nuestro trabajo en la mitosis en Drosophila es apoyado por el NIH subvención GM55507.

Recetas: Placas de jugo de uvas: <ul><li> 5,5 g de agar Bacto </li><li> 14,5 g de dextrosa o glucosa </li><li> 7,15 g de sacarosa </li><li> 45 ml de jugo concentrado de uva (jugo 100%). </li><li> 204.5 ml H 2 0 </li><li> 625 l de NaOH 10N </li></ul> Mezcle todos los ingredientes y horno de microondas hasta que hierva. Añadir la mezcla 2,8 ml de ácido (mezcla de ácidos: 20,9 ml de ácido propiónico, 2,1 ml de ácido fosfórico, 27 ml H 2...

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	<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila.">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos.">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li><li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis.">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li><li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+anaphase+B:+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation.">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos.">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li><li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states.">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li><li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch:+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient.">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromokinesin,+KLP3A,+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility.">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos.">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+kinesin,+KLP61F,+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles.">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li><li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos.">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy,+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li></ol>

Este protocolo es relativamente sencillo, sin embargo, cada paso requiere de práctica para asegurarse de que los embriones no están dañados. Cuidadosos experimentos de control siempre se necesita hacer para asegurar que los resultados se están obteniendo fiables. Una buena manera de comenzar es mediante la microinyección de tubulina buffer o rodamina en embriones de control que expresan GFP-tubulina para asegurarse de que la mitosis procede normalmente a través de todos los ciclos en la superficie del embrión (ci...

microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo

Este protocolo describe el uso del embrión de Drosophila melanogaster sincitial para el estudio de la mitosis 1. Drosophila tiene una genética útil con un genoma secuenciado, y puede ser fácil de mantener y manipular. Muchos mutantes de mitosis existen, y las moscas transgénicas que expresan funcionales fluorescente (GFP, por ejemplo) - etiquetado proteínas mitótico han estado y están generando. Expresión de genes diana es posible utilizar el sistema GAL4/UAS 2. El embrión de Drosophila temprana lleva a cabo múltiples mitosis muy rápidamente (la duración del ciclo celular, ≈ 10 min). Es muy adecuado para obtener imágenes de la mitosis, ya que durante los ciclos de 10-13, los núcleos se dividen rápidamente y de forma sincrónica sin intervenir citocinesis en la superficie del embrión en una sola monocapa justo debajo de la corteza cerebral. Estos núcleos se dividen rápidamente, probablemente el uso de la maquinaria mitótica igual que otras células, pero que están optimizados para la velocidad, el puesto de control general, se cree que no se estrictas, lo que permite el estudio de las proteínas mitótico cuya ausencia podría causar detención del ciclo celular en células con un control fuerte . Los embriones que expresan proteínas GFP etiquetados o microinyección con la etiqueta fluorescente proteínas pueden ser fácilmente imágenes para seguir la dinámica de vida (Fig. 1). Además, los embriones pueden ser microinyección con el bloqueo de la función-anticuerpos o inhibidores de proteínas específicas para estudiar el efecto de la pérdida o la perturbación de su función 3. Estos reactivos se difunden en todo el embrión, llegando a muchos ejes para producir un gradiente de concentración del inhibidor, lo que a su vez se traduce en un gradiente de defectos comparable a una serie de alelos de mutantes. Idealmente, si la proteína diana es marcado con fluorescencia, el gradiente de inhibición se puede visualizar directamente 4. Se supone que el más fuerte fenotipo es comparable con el fenotipo nulo, a pesar de que es difícil excluir formalmente la posibilidad de que los anticuerpos pueden tener efectos dominantes en raras ocasiones, los controles tan rigurosos y una prudente interpretación debe ser aplicada. Más lejos del sitio de la inyección, la función de proteínas es sólo parcialmente perdido permitir otras funciones de la proteína diana a hacerse evidente.

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Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en el<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Embrión sincitial para estudiar mitosis.

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

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