Name: microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo at JoVE.com

Bu protokol şu anda bizim laboratuvarda kullanılan ve Dr David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur dahil olmak üzere pek çok kişi tarafından yıllar boyunca rafine olmuştur. Biz bu sistemde çalışma başlatılan erken Drosophila embriyoların manipülasyon ve mikroenjeksiyon (bkz. 13) mükemmel tavsiye bize sağladığı Dr Bill Sullivan (UCSC) teşekkür ederim. Biz tüm üyelerine Scholey laboratuvar teşekkür ediyorum. Drosophila mitoz üzerinde yaptığımız çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe GM55507 tarafından destekleniyor .

Tarifler: Üzüm Suyu plakalar: <ul><li> 5.5g bacto agar </li><li> 14.5 gr dekstroz veya glukoz </li><li> 7.15 g sakaroz </li><li> 45 ml üzüm suyu konsantresi (% 100 meyve suyu). </li><li> 204.5 ml H 2 0 </li><li> 625 ul 10N NaOH </li></ul> Tüm malzemeyi ve mikrodalga kaynayana kadar karıştırın. 2.8 ml asit karışımı (20.9 ml propiyonik asit, 2.1 ml fosforik asit, 27 ml H 2 0 asit karışımı) 35 mm P...

<ol>
	<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila.">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos.">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li><li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis.">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li><li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+anaphase+B:+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation.">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos.">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li><li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states.">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li><li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch:+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient.">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromokinesin,+KLP3A,+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility.">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos.">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+kinesin,+KLP61F,+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles.">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li><li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos.">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy,+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li></ol>

Bu protokol, ancak her adım embriyoların zarar görmediğinden emin olmak için pratik gerektirir, nispeten basittir. Dikkatli kontrol deneyleri her zaman güvenilir sonuçlar elde ediliyor olmasını sağlamak için yapılması gerekir. Iyi bir şekilde başlamak için GFP-tubulin ifade mitoz embriyo yüzey (döngüleri 13 üzerinden 10) tüm döngüleri ile normal olarak devam eder emin olmak için kontrol embriyolar içine tampon veya rodamin tubulin microinjecting. Kontrolü embriyolar, genellikle çok fazla dehid...

microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo

Bu protokol, Drosophila melanogaster sinsityal embriyo mitoz 1 eğitim için kullanımı anlatılmaktadır. Drosophila sıralı genomu ile yararlı genetik ve kolayca korunur ve manipüle edilebilir. Birçok mitotik mutantlar var ve (örneğin, GFP) floresan fonksiyonel ifade transgenik sinekler etiketli mitotik proteinler edilmiş ve üretildikten sonra. Hedeflenen gen ekspresyonu GAL4/UAS sistemi 2 ile mümkündür. Drosophila erken embriyo (hücre döngüsü süresi, ≈ 10 dk), birden mitoz çok hızlı bir şekilde yürütmektedir . Döngüleri 10-13 sırasında, çekirdeklerin, korteks hemen altında tek tek tabakalı embriyonun yüzeyindeki sitokinez müdahale olmadan hızlı bir şekilde ve eşzamanlı olarak bölmek, çünkü iyi görüntüleme mitoz için uygundur. Bu hızla bölünerek çekirdekleri, muhtemelen, diğer hücrelerin aynı mitotik makine kullanımı, ancak hız için optimize edilmiş, kontrol noktasında genellikle yokluğu güçlü bir kontrol noktasında hücreler hücre siklusu durmasına neden olur mitotik proteinlerin çalışma izin sıkı olmamalıdır inanılmaktadır . Veya GFP etiketli proteinlerin ifade Embriyolar floresan ile işaretlenmiş proteinler microinjected canlı dinamikleri takip etmek (Şekil 1) kolayca görüntülü olabilir. Buna ek olarak, embriyoların 3, işlev kaybı veya pertürbasyon etkisini araştırmak için spesifik proteinlerin fonksiyonu bloke edici antikorlar veya inhibitörleri ile microinjected olabilir. Bu reaktifler inhibitör konsantrasyonunun bir degrade, mutant alel serisi ile karşılaştırılabilir kusurları bir degrade dönüş sonuçlar üretmek için birçok iğ ulaşan embriyo boyunca diffüz İdeal olarak, hedef proteinin floresan etiketli ise inhibisyon degrade 4 direkt görüntülenebilmekte olabilir. Resmen antikorlar uygulanması gereken nadir durumlarda, bu kadar sıkı kontrol ve ihtiyatlı yorumu baskın etkileri olabileceği olasılığını dışlamak için zor olsa da, güçlü fenotip boş fenotip karşılaştırılabilir olduğu varsayılır. Enjeksiyon yerinden daha uzak, protein fonksiyonu sadece kısmen hedef proteinin diğer işlevler belirgin hale izin kaybetti.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo at JoVE.com

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Bu protokol, mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı açıklanır<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sinsityal embriyo mitoz çalışma.

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Drosophila (meyve sineği) Saldırganlık incelenmesi

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...