Name: an in vitro fluoroblok tumor invasion assay
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

Post-etikettering en metingen met behulp van BD calceïne AM fluorescerende kleurstof Cellen worden gelabeld voor kwantificering nadat ze zijn binnengedrongen via de BD Matrigel Matrix en doorgegeven via de BD FluoroBlok membraan. Als gevolg hiervan kan alleen eindpunt meting van de cel invasie worden verkregen. <ol><li> Grow-cellen tot ~ 80% confluentie. </li><li> Voor te bereiden en te rehydrateren de insert-systeem. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Verwijder de verpakking van -20 ° C opslag en laat deze op kamertemperatuur komen. </li><li> Open de folie verpakking en voeg 500 ul warm (37 ° C) media om de binnenkant van de insert putten. Laat de plaat gedurende 2 uur hydrateren bij 37 ° C, 5% CO 2. Opmerking: Het is niet nodig om de ongecoate BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Systeem dat gebruikt zal worden als een cel migratie controle te hydrateren. </li><li> Na rehydratie, verwijder het medium van de insert putten zonder de laag van BD Matrigel Matrix op het membraan. Het systeem is nu klaar voor gebruik. </li></ol></li><li> Bereid celsuspensies door trypsinizing celmonolagen en resuspenderen de cellen in serum-vrij DMEM bij 5 x 10 4 cellen / ml. Opmerking: Als u gebruik maakt van een andere cel type dat u nodig hebt om het optimale zaaien dichtheid te bepalen. Voor het bepalen van de optimale dichtheid van zaaien voor je mobiele typen op een poreuze ondergrond groei, gebruik van een scala van zaaien dichtheden (cellen / cm 2) dat tussen haakjes het zaaien dichtheid gebruikt op niet-poreuze ondergronden (bv. flessen, schalen en borden). Bijvoorbeeld, als je op dit moment zaad op 2,5 x 10 5 cellen / cm 2, zaad op verschillende cel concentraties tussen 5 x 10 4 en 5 x 10 5 cellen / cm 2 om de optimale eerste seeding dichtheid te bepalen. </li><li> Voeg 500 ul van celsuspensie (2,5 x 10 4 cellen) aan de apicale kamers. </li><li> Voeg 750 ul van chemoattractant (5% FBS in DMEM) aan elk van de basale kamers, met behulp van de steekproef poorten voor toegang. </li><li> Incubeer de BD BioCoat tumorinvasie System en de ongecoate BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate voor 20-22 uur bij 37 ° C, 5% CO 2 atmosfeer. </li><li> Na de incubatie, verwijder voorzichtig medium van de apicale kamers. Dit kan worden bereikt door flicking de inhoud in een afvalbak. Raak de onderkant van de insert-systeem. </li><li> Overdracht van de insert-systeem in een tweede 24-wells plaat met 500 ul / putje van 4 ng / mL Calceïne AM in HBSS. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. De Calceïne AM oplossing is niet verwijderd uit de Tweede Kamer vóór het lezen van fluorescentie want het is een nonfluorescent vitale kleurstof die in het groen fluorescent calceïne omgezet door cytosolische esterases. </li><li> Fluorescentie van binnengevallen cellen wordt afgelezen op golflengten van 494 / 517 nm (Ex / Em) op een bottom-het lezen van fluorescerende plaat lezer. De winst instelling kan nodig zijn om empirisch worden bepaald, maar een middelpunt te krijgen moet een voldoende uitgangspunt. Een winst instelling die te hoog is kan leiden tot verzadiging van de detector met zeer fluorescerende monster, dit kan de overname van zinvolle resultaten te voorkomen. Gebruik van de Automatische versterkingsregeling (indien ondersteund op uw lezer) wordt niet aanbevolen. Een omgekeerde fluorescentie microscoop kan worden gebruikt om uw resultaten te verifiëren, het is vooral nuttig om dit te doen de eerste keer dat u deze test. Opmerking: Het is van het grootste belang dat de Insert-systemen worden gelezen met behulp van de juiste plaat kaart. Voor informatie over het laden plaat kaarten te zien BD Technical Bulletin No 436 op www.bdbiosciences.com of neem contact op BD Technical Support (labware@bd.com). Een goede plaat oriëntatie is met een goed A1 bij de linker bovenhoek en de BD Flacon logo gericht op rechts, zoals de plaat wordt geplaatst in de lezer. </li></ol> Datareductie Worden uitgedrukt als in de volgende vergelijking: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="Vergelijking" /> Achtergrond kan worden afgetrokken voor de berekening van de cel procent invasie RFU = relatieve TL-eenheden.

<ol>
	<li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol,+a+novel+triterpene,+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-&#922;B+activation.">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-&#x03BA;B-regulated gene products and TAK1-mediated NF-&#922;B activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li><li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-&#x03BA;B+Activation+by+Inhibiting+I&#x03BA;B&#x03B1;+Kinase+Activation,+Thereby+Suppressing+NF-&#x03BA;B-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression,+Up-regulating+Apoptosis,+and+Inhibiting+Invasion.">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-&#x03BA;B Activation by Inhibiting I&#x03BA;B&#x03B1; Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-&#x03BA;B-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li><li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+cysteini+residues+in+I&#x03BA;B&#x03B1;+kinase+and+NF-&#x03BA;B+(p65)+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells.">Modification of the cysteini residues in I&#x03BA;B&#x03B1; kinase and NF-&#x03BA;B (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-&#x03BA;B-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li><li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. e. g. u. e. l. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+Akt+Inhibitor,+Suppresses+I&#922;B&#945;+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-&#x03BA;B-Regulated+Gene+Expression,+Potentiation+of+Apoptosis,+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion.">an Akt Inhibitor, Suppresses I&#922;B&#945; Kinase Activation Leading to Suppression of NF-&#x03BA;B-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li><li>Partridge, J., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+High-Throughput+Screening+of+Tumor+Cell+Invasion+using+a+Cell-based+Model.">Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model.</a> Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+In+Vitro+Device+For+Measuring+Cell+Invasion+and+Method+for+its+Formation.">An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation.</a> US patent. , (2004).</li><li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds.">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li><li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds+by+a+Fluorescence+Based+Tumor+Invasion+Assay.">Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay.</a> Screentech 2001 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Quantitative,+High-Throughput+Assay+System+for+the+Discovery+of+Anti-Cancer+Drugs.">Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs.</a> Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. , (1999).</li></ol>

De auteurs zijn medewerkers van BD Biosciences die reagentia en instrumenten die in dit artikel oplevert.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BD BioCoat Tumor Invasion System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354165 or 354166</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HT-1080 and NIH/3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351157 or 351158</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% Fetal Bovine Serum in DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Calcein AM Fluorescent Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354216 or 354217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks&#x2019; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an in vitro fluoroblok tumor invasion assay

Het kenmerk van metastatische cellen is hun vermogen om binnen te dringen door het basaal membraan en migreren naar andere delen van het lichaam. Cellen moeten in staat zijn om zowel scheiden proteases die breken de basaalmembraan en migreren om te worden invasief. BD BioCoat Tumor Invasion systeem biedt cellen met voorwaarden dat de beoordeling van hun invasieve eigendom toe<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Het bestaat uit een BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate met een 8,0 micron poriegrootte van PET-membraan dat is gelijkmatig is bedekt met BD Matrigel Matrix. Deze uniforme laag van BD Matrigel Matrix fungeert als een gereconstitueerde basaalmembraan<em&gt; In vitro</em&gt; Het verstrekken van een echte barrière voor niet-invasieve cellen, terwijl de presentatie van een geschikte eiwit structuur voor invasie te bestuderen. De coating proces afsluit de poriën van het membraan, het blokkeren van niet-invasieve cellen van migreren door het membraan. In tegenstelling tot invasieve cellen in staat zijn om zich los te maken van en door het gecoate membraan migreren. Kwantificering van de cel invasie kan worden bereikt door zowel pre-of post-cel invasie labelen met een fluorescerende kleurstof, zoals DiIC<sub&gt; 12</sub&gt; (3) of calceïne AM, respectievelijk, en het meten van de fluorescentie van binnendringende cellen. Sinds de BD FluoroBlok membraan effectief blokkeert de doorgang van het licht 490 tot 700 nm bij&gt; 99% efficiency, fluorescent-gemerkte cellen die niet zijn binnengedrongen worden niet gedetecteerd door een bottom-het lezen van fluorescentie plate reader. Echter, cellen die zijn binnengedrongen aan de onderkant van het membraan niet meer afgeschermd van de lichtbron en worden gedetecteerd met de respectievelijke plaat lezer. Deze video toont een eindpunt cel invasie assay, met behulp van calceïne uur tot binnengevallen cellen te detecteren.

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Deze video laat zien hoe cel invasie te meten door middel van celkweek voegt met behulp van een fluorescentie-gebaseerde methodiek.

Een In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Test voor Adhesie en Agar invasie in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Toepassing van een<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Protection Assay om stress Mediation Eigenschappen van de Dps Protein Visualiseer

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro cel-migratie en invasie assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...