Name: an in vitro fluoroblok tumor invasion assay
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00
Duration: 7 min 53 s
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Post-Kennzeichnung und Messung mittels BD Calcein AM Fluoreszenzfarbstoff Die Zellen sind für die Quantifizierung bezeichnet, nachdem sie durch die BD Matrigel Matrix eingedrungen sind und durch die BD FluoroBlok Membran. Als Ergebnis kann nur Endpunkt Messung der Zell-Invasion erreicht werden. <ol><li> Wachsen Zellen auf ~ 80% Konfluenz. </li><li> Vorbereiten und rehydrieren die Insert-System. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Entfernen Sie das Paket von -20 ° C Lagerung und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur kommen. </li><li> Öffnen Sie die Folienverpackung und fügen 500 mL warmen (37 ° C) Medien in das Innere des Einsatzes Brunnen. Lassen Sie die Platte für 2 Stunden bei 37 rehydrieren ° C, 5% CO 2. Hinweis: Es ist nicht notwendig, die unbeschichteten BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert-System, das als Zellmigration Steuerung verwendet werden rehydrieren. </li><li> Nach Rehydrierung, entfernen Sie vorsichtig das Medium aus dem Einsatz Brunnen, ohne die Schicht der BD Matrigel Matrix auf der Membran. Das System ist nun einsatzbereit. </li></ol></li><li> Bereiten Zellsuspensionen von trypsinizing Zellmonoschichten und Resuspendieren der Zellen in serumfreiem DMEM mit 5 x 10 4 Zellen / ml. Hinweis: Wenn Sie einen anderen Zelltyp sind, müssen Sie die optimale Aussaatdichte bestimmen. Zur Bestimmung der optimalen Aussaatdichte für Ihren Zelltyp auf einer porösen Oberfläche Wachstum, nutzen eine Reihe von Aussaatdichten (Zellen / cm 2), dass die Träger der Aussaatdichte auf porösen Oberflächen verwendet (dh Flaschen, Schüsseln und Teller). Zum Beispiel, wenn Sie derzeit Samen bei 2,5 x 10 5 Zellen / cm 2, Saatgut an verschiedenen Zell-Konzentrationen zwischen 5 x 10 4 und 5 x 10 5 Zellen / cm 2, um die optimale anfängliche Aussaatdichte bestimmen. </li><li> Add 500 ul Zellsuspension (2,5 x 10 4 Zellen) zur apikalen Kammern. </li><li> Add 750 ul von Lockstoff (5% FBS in DMEM) auf jeden der basalen Kammern, mit der Probe-Ports für den Zugriff. </li><li> Inkubieren Sie die BD BioCoat Tumor Invasion System und die unbeschichtete BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Einlegeplatte für 20-22 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2-Atmosphäre. </li><li> Nach der Inkubation vorsichtig Medium aus dem apikalen Kammern. Dies kann durch flicking den Inhalt in einen Abfallbehälter erreicht werden. Berühren Sie nicht die Unterseite des Einsatzes System. </li><li> Übertragen Sie die Insert-System in einen zweiten 24-Well-Platte mit 500 ul / Vertiefung von 4 pg / mL Calcein AM in HBSS. Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO 2. Die Calcein AM-Lösung ist nicht von der unteren Kammer vor dem Lesen Fluoreszenz entfernt werden, da es sich um eine nicht-fluoreszierenden Vitalfarbstoffs, die in grün fluoreszierendes Calcein durch cytosolische Esterasen umgewandelt wird. </li><li> Fluoreszenz der befallenen Zellen ist bei Wellenlängen von 494/517 nm (Ex / Em) auf einem Bottom-Lektüre fluoreszierenden Platte gelesen. Der Gain-Einstellung müssen empirisch ermittelt werden, aber einen Mittelpunkt erhalten sollten eine ausreichende Ausgangspunkt sein. Ein Gain-Einstellung, die zu hoch ist, kann bis zur Sättigung des Detektors mit stark fluoreszierenden Probe führen, dies kann die Übernahme von aussagekräftigen Ergebnissen zu verhindern. Verwendung von Autogain (falls auf Ihrem Leser unterstützt) wird nicht empfohlen. Eine invertierte Fluoreszenzmikroskop können Sie Ihre Ergebnisse zu überprüfen, ist es besonders hilfreich, dies zu tun das erste Mal, wenn Sie diesen Test. Hinweis: Es ist von größter Bedeutung, dass der Insert-Systeme lesen Sie den richtigen Platte Karte. Informationen zum Einlegen Platte Karten siehe BD Technical Bulletin Nr. 436 auf www.bdbiosciences.com oder kontaktieren BD Technical Support (labware@bd.com). Proper Platte Orientierung ist mit gut A1 in der linken oberen Ecke und die BD Flacon Logo orientiert sich an der rechten Seite, die Platte in das Lesegerät eingelegt wird. </li></ol> Data Reduction Die Daten werden wie in der folgenden Gleichung ausgedrückt: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="Gleichung" /> Hintergrund kann vor der Berechnung der prozentualen Zellinvasion abgezogen werden RFU = relative Fluoreszenz-Einheiten.

<ol>
	<li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol,+a+novel+triterpene,+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-&#922;B+activation.">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-&#x03BA;B-regulated gene products and TAK1-mediated NF-&#922;B activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li><li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-&#x03BA;B+Activation+by+Inhibiting+I&#x03BA;B&#x03B1;+Kinase+Activation,+Thereby+Suppressing+NF-&#x03BA;B-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression,+Up-regulating+Apoptosis,+and+Inhibiting+Invasion.">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-&#x03BA;B Activation by Inhibiting I&#x03BA;B&#x03B1; Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-&#x03BA;B-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li><li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+cysteini+residues+in+I&#x03BA;B&#x03B1;+kinase+and+NF-&#x03BA;B+(p65)+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells.">Modification of the cysteini residues in I&#x03BA;B&#x03B1; kinase and NF-&#x03BA;B (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-&#x03BA;B-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li><li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. e. g. u. e. l. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+Akt+Inhibitor,+Suppresses+I&#922;B&#945;+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-&#x03BA;B-Regulated+Gene+Expression,+Potentiation+of+Apoptosis,+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion.">an Akt Inhibitor, Suppresses I&#922;B&#945; Kinase Activation Leading to Suppression of NF-&#x03BA;B-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li><li>Partridge, J., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+High-Throughput+Screening+of+Tumor+Cell+Invasion+using+a+Cell-based+Model.">Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model.</a> Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+In+Vitro+Device+For+Measuring+Cell+Invasion+and+Method+for+its+Formation.">An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation.</a> US patent. , (2004).</li><li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds.">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li><li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds+by+a+Fluorescence+Based+Tumor+Invasion+Assay.">Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay.</a> Screentech 2001 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Quantitative,+High-Throughput+Assay+System+for+the+Discovery+of+Anti-Cancer+Drugs.">Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs.</a> Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. , (1999).</li></ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter von BD Biosciences, dass Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>BD BioCoat Tumor Invasion System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354165 or 354166</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HT-1080 and NIH/3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351157 or 351158</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% Fetal Bovine Serum in DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Calcein AM Fluorescent Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354216 or 354217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks&#x2019; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an in vitro fluoroblok tumor invasion assay

Das Markenzeichen von metastatischen Zellen ist ihre Fähigkeit, durch die Basalmembran dringen und wandern in andere Teile des Körpers. Die Zellen müssen in der Lage, sowohl sezernieren Proteasen, die zum Abbau der Basalmembran sowie wandern, um zu invasiv. BD BioCoat Tumor Invasion System bietet Zellen mit Bedingungen, die Bewertung ihrer invasive Eigenschaft erlauben<em&gt; In-vitro-</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Es besteht aus einem BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Einlegeplatte mit einem 8,0 Mikron Porengröße PET-Membran, die gleichmäßig mit BD Matrigel Matrix beschichtet. Diese einheitliche Schicht von BD Matrigel Matrix dient als rekonstituierte Basalmembran<em&gt; In-vitro-</em&gt; Vermittlung eines den tatsächlichen Hindernis für non-invasive Zellen während der Präsentation eine entsprechende Protein-Struktur, die Invasion zu studieren. Die Beschichtung verschließt die Poren der Membran, blockiert nicht-invasive Zellen aus der Migration durch die Membran. Im Gegensatz dazu sind invasive Zellen in der Lage, sich aus zu lösen und wandern durch die beschichtete Membran. Die Quantifizierung der Zellinvasion kann entweder durch Pre-oder Post-Zell-Invasion Markierung mit einem fluoreszierenden Farbstoff wie DiIC erreicht werden<sub&gt; 12</sub&gt; (3) oder Calcein AM, bzw., und die Messung der Fluoreszenz der eindringenden Zellen. Da die BD FluoroBlok Membran effektiv blockiert den Durchgang von Licht von 490 bis 700 nm bei&gt; 99% Wirkungsgrad, fluoreszenzmarkierte Zellen, die nicht besetzt haben, sind nicht durch einen Boden-reading-Fluoreszenz-Reader erkannt. Allerdings sind Zellen, die an der Unterseite der Membran eingedrungen sind nicht mehr von der Lichtquelle abgeschirmt und sind mit den jeweiligen Platten-Lesegerät erkannt werden. Dieses Video zeigt einen Endpunkt Zellinvasion Assay, mit Calcein AM zu befallenen Zellen zu erkennen.

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An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Dieses Video zeigt, wie man Zellen Invasion durch Zellkultur-Einsätze mit einem Fluoreszenz-basierten Methoden zu messen.

Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay

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