Name: an in vitro fluoroblok tumor invasion assay
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

פוסט תיוג ומדידה באמצעות BD calcein AM צבע פלואורסצנטי תאים מסומנים עבור quantitation לאחר שהם פלשו דרך Matrigel BD מטריקס עברה דרך הממברנה BD FluoroBlok. כתוצאה מכך, רק מדידת נקודת הסיום של הפלישה תא ניתן לקבל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים מפגש ~ 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את רעננותם ואת המערכת להוסיף. <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החבילה אחסון -20 ° C ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החבילה בנייר ולהוסיף 500 μL חמים (37 מעלות צלזיוס) התקשורת הפנים של בארות להוסיף. אפשר צלחת כדי רעננותם עבור 2 שעות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הערה: אין צורך רעננותם ציפוי BD פלקון FluoroBlok 24-Multiwell מערכת הכנס שישמש כביקורת נדידת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התייבשות, להסיר בזהירות את המדיום מבארות להוסיף מבלי להפריע את שכבת BD Matrigel מטריקס על הממברנה. המערכת נמצאת כעת מוכן לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות התא על ידי trypsinizing monolayers התא resuspending התאים בדם ללא DMEM ב 5 x 10 4 תאים / מ&quot;ל. הערה: אם אתה משתמש סוג תא אחר אתה צריך לקבוע את צפיפות זריעה אופטימלית. כדי לקבוע את צפיפות זריעה אופטימלית עבור סוג הסלולרי שלך על משטח נקבובי הצמיחה, להשתמש במגוון של צפיפות זריעה (תאים / ס&quot;מ 2) כי הסוגריים צפיפות זריעה בשימוש על משטחים nonporous (כלומר, צלוחיות, צלחות וצלחות). לדוגמה, אם אתה כרגע זרע ב 2.5 x 10 תאים 5 / 2 ס&quot;מ, זרע בריכוזים תאים שונים בין 5 x 10 x 4 ו -5 תאים 10 5 / 2 ס&quot;מ, כדי לקבוע את צפיפות אופטימלי זריעת הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL ההשעיה תא (2.5 x 10 4 תאים) לתאי apical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 750 μL של chemoattractant (5% ב FBS DMEM) לכל אחד מתאי הבסיס, באמצעות יציאות מדגם עבור גישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה גידול BioCoat BD הפלישה מערכת ציפוי BD פלקון FluoroBlok 24-Multiwell פלייט הכנס עבור 20-22 שעות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באטמוספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להסיר בזהירות בינוני מתאי apical. ניתן להשיג זאת על ידי מצליף את התוכן לתוך מיכל פסולת. אל תיגע במשטח התחתון של המערכת להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המערכת להכניס צלחת 24 היטב נוספת שהכילה 500 μL / טוב של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Calcein AM ב HBSS. דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הפתרון AM Calcein לא יוסר החדר התחתון לפני קריאת הקרינה כי זה צבע חיוני nonfluorescent כי מומר calcein פלואורסצנטי ירוק על ידי esterases cytosolic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרינה של התאים פלשו קוראים באורכי גל של 494/517 ננומטר (אקס / em) על הקורא התחתונה קריאה צלחת ניאון. הגדרת רווח ייתכן שיהיה צורך נקבע באופן אמפירי, אך רווח האמצע צריך להיות נקודת התחלה מספיק. הגדרה רווח זה גבוה מדי עלול להוביל הרוויה של הגלאי עם מדגם ניאון מאוד, זה עשוי למנוע את הרכישה של תוצאות משמעותיות. השימוש autogain (אם נתמך על הקורא שלך) אינה מומלצת. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה ניתן להשתמש כדי לאמת את התוצאות שלך, זה מועיל במיוחד לעשות את זה בפעם הראשונה שתפעיל את זה assay. הערה: זה הוא בעל חשיבות עליונה כי מערכות הכנס נקראים באמצעות צלחת המפה הנכונה. למידע על מפות צלחת טעינת לראות BD עלון טכני מס &#39;436 על www.bdbiosciences.com או צרו קשר עם BD תמיכה טכנית (labware@bd.com). אוריינטציה צלחת פרופר הוא עם A1 גם בפינה השמאלית העליונה ואת הלוגו Flacon BD אוריינטציה ימינה כמו צלחת מוכנס לתוך הקורא. </li></ol> נתוני הפחתת נתונים מבוטא במשוואה הבאה: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="משוואה" /> רקע יכול להיות מופחתים לפני החישוב של הפלישה תא אחוזים RFU = יחידות פלורסנט יחסית.

<ol>
	<li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol,+a+novel+triterpene,+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-&#922;B+activation.">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-&#x03BA;B-regulated gene products and TAK1-mediated NF-&#922;B activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li><li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-&#x03BA;B+Activation+by+Inhibiting+I&#x03BA;B&#x03B1;+Kinase+Activation,+Thereby+Suppressing+NF-&#x03BA;B-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression,+Up-regulating+Apoptosis,+and+Inhibiting+Invasion.">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-&#x03BA;B Activation by Inhibiting I&#x03BA;B&#x03B1; Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-&#x03BA;B-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li><li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+cysteini+residues+in+I&#x03BA;B&#x03B1;+kinase+and+NF-&#x03BA;B+(p65)+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells.">Modification of the cysteini residues in I&#x03BA;B&#x03B1; kinase and NF-&#x03BA;B (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-&#x03BA;B-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li><li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. e. g. u. e. l. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+Akt+Inhibitor,+Suppresses+I&#922;B&#945;+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-&#x03BA;B-Regulated+Gene+Expression,+Potentiation+of+Apoptosis,+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion.">an Akt Inhibitor, Suppresses I&#922;B&#945; Kinase Activation Leading to Suppression of NF-&#x03BA;B-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li><li>Partridge, J., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+High-Throughput+Screening+of+Tumor+Cell+Invasion+using+a+Cell-based+Model.">Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model.</a> Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+In+Vitro+Device+For+Measuring+Cell+Invasion+and+Method+for+its+Formation.">An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation.</a> US patent. , (2004).</li><li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds.">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li><li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds+by+a+Fluorescence+Based+Tumor+Invasion+Assay.">Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay.</a> Screentech 2001 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Quantitative,+High-Throughput+Assay+System+for+the+Discovery+of+Anti-Cancer+Drugs.">Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs.</a> Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. , (1999).</li></ol>

הכותבים הם עובדי BD Biosciences המייצרת ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BD BioCoat Tumor Invasion System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354165 or 354166</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HT-1080 and NIH/3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351157 or 351158</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% Fetal Bovine Serum in DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Calcein AM Fluorescent Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354216 or 354217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks&#x2019; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an in vitro fluoroblok tumor invasion assay

סימן ההיכר של תאים גרורתי הוא היכולת שלהם לחדור דרך הממברנה המרתף לעבור לחלקים אחרים של הגוף. תאים צריכים להיות מסוגלים גם להפריש פרוטאזות כי לשבור את קרום מרתף וכן להעביר כדי להיות פולשני. BD הפלישה BioCoat המערכת מספקת גידול התאים בתנאים המאפשרים הערכה של הרכוש שלהם פולשנית<em&gt; במבחנה</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. זה מורכב פלקון BD FluoroBlok 24-Multiwell פלייט הכנס עם 8.0 מיקרון נקבוביות הממברנה PET בגודל זה כבר מצופה באופן אחיד עם BD Matrigel מטריקס. זו שכבה אחידה של BD Matrigel מטריקס משמשת קרום מרתף מחדש<em&gt; במבחנה</em&gt; מתן מחסום אמיתי פולשני תאים תוך הצגת מבנה החלבון המתאים ללמוד הפלישה. תהליך ציפוי חוסם את הנקבוביות של הממברנה, חסימת פולשני תאים נודדים דרך הממברנה. לעומת זאת, התאים פולשניים מסוגלים לנתק את עצמם ולהעביר דרך הממברנה מצופה. Quantitation הפלישה התא יכולה להיות מושגת על ידי תיוג או לפרסם תאים טרום הפלישה או עם פלורסנט לצבוע כמו המבת&quot;ן<sub&gt; 12</sub&gt; (3) או calcein בבוקר, בהתאמה, מדידת הקרינה של תאים פולשים. מאז קרום FluoroBlok BD ביעילות חוסם את המעבר של אור 490-700 ננומטר ביעילות&gt; 99%, fluorescently שכותרתו תאים לא פלשו לא מזוהים על ידי הקורא התחתונה קריאה צלחת פלואורסצנטי. עם זאת, התאים פלשו לחלק התחתון של הקרום אינם מוגנים ממקור אור מזוהים עם הקורא את הצלחת בהתאמה. וידאו זה מדגים תא הסיום assay הפלישה, באמצעות calcein AM לזהות תאים פלשו.

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

וידאו זה מדגים כיצד למדוד את הפלישה תא דרך התרבות מוסיף התא באמצעות מתודולוגיה מבוססת הקרינה.

במבחנה Invasion FluoroBlok גידול Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

יישום של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay הגנת ה-DNA כדי להמחיש את מאפייני גישור לחץ של חלבון DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...