Name: an in vitro fluoroblok tumor invasion assay
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

डाक लेबलिंग और माप बी.डी. calcein का उपयोग फ्लोरोसेंट रंजक कक्ष quantitation के लिए लेबल के बाद वे बी.डी. Matrigel मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण किया है और बी.डी. FluoroBlok झिल्ली के माध्यम से पारित कर रहे हैं. एक परिणाम के रूप में, केवल सेल आक्रमण के endpoint माप प्राप्त किया जा सकता है. <ol><li> ~ 80% संगम कोशिकाओं के विकास. </li><li> डालने प्रणाली तैयार और rehydrate. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से पैकेज निकालें और यह कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं. </li><li> पन्नी पैकेज खोलें और डालने के कुओं के इंटीरियर के लिए 500 μL गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मीडिया जोड़ने. थाली 2 घंटे के लिए 37 rehydrate करने की अनुमति दें ° सी, 5% सीओ 2. नोट: यह uncoated बी.डी. फाल्कन 24 multiwell सम्मिलित प्रणाली है कि एक सेल प्रवास नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा FluoroBlok rehydrate करने के लिए आवश्यक नहीं है. </li><li> पुनर्जलीकरण के बाद, ध्यान से कुओं से सम्मिलित झिल्ली पर बी.डी. Matrigel मैट्रिक्स की परत के बिना परेशान मध्यम हटाने. सिस्टम अब का उपयोग करने के लिए तैयार है. </li></ol></li><li> सेल monolayers trypsinizing और सीरम मुक्त DMEM में 5 x 10 4 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं resuspending सेल निलंबन तैयार करें. नोट: यदि आप एक अलग सेल प्रकार का उपयोग कर रहे हैं आप के लिए इष्टतम बोने घनत्व को निर्धारित करने की आवश्यकता है . एक झरझरा वृद्धि की सतह पर अपने सेल प्रकार के लिए इष्टतम बोने घनत्व को निर्धारित करने के लिए, बोने के घनत्व की एक सीमा (कोशिकाओं / 2 सेमी) का उपयोग करें कि कोष्ठक बोने nonporous सतहों पर इस्तेमाल किया घनत्व ( यानी बोतल, बर्तन, और प्लेट). उदाहरण के लिए, यदि आप 2.5 x 10 के बीच विभिन्न सेल सांद्रता में 5 / कोशिकाओं 2 सेमी, बीज पर वर्तमान में बीज 5 x 4 10 और 5 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी करने के लिए इष्टतम प्रारंभिक बोने घनत्व निर्धारण. </li><li> शिखर कक्षों सेल निलंबन के 500 μL (2.5 x 4 कोशिकाओं 10) जोड़ें. </li><li> बेसल कक्षों में से प्रत्येक के 750 μL chemoattractant (DMEM में 5% FBS) जोड़ें, उपयोग के लिए नमूना बंदरगाहों का उपयोग. </li><li> बी.डी. BioCoat ट्यूमर आक्रमण सिस्टम और uncoated बी.डी. फाल्कन 24 multiwell 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 माहौल में 20-22 घंटे के लिए सम्मिलित प्लेट FluoroBlok सेते हैं. </li><li> ऊष्मायन के बाद, ध्यान शिखर कक्षों से मध्यम हटायें. यह बर्बादी कंटेनर में सामग्री flicking द्वारा पूरा किया जा सकता है. डालने प्रणाली के निचले सतह को छूने मत करो. </li><li> एक दूसरे 24 अच्छी तरह से 500 / अच्छी तरह से 4 μg / एमएल HBSS में AM Calcein μL युक्त थाली में डालने प्रणाली स्थानांतरण. 37 पर 1 घंटे के लिए सेते ° सी, 5% सीओ 2. Calcein AM समाधान प्रतिदीप्ति पढ़ने से पहले निचले सदन से हटाया नहीं है क्योंकि यह एक nonfluorescent महत्वपूर्ण डाई है कि हरी फ्लोरोसेंट calcein में साइटोसोलिक esterases द्वारा कनवर्ट किया जाता है है. </li><li> आक्रमण कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति नीचे पढ़ने फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक पर 494/517 एनएम (पूर्व / एम) के तरंग दैर्ध्य को पढ़ने के लिए है. लाभ सेटिंग empirically निर्धारित किया जा जरूरत है, लेकिन हो सकता है एक मध्य लाभ पर्याप्त प्रारंभ बिंदु होना चाहिए. एक लाभ सेटिंग है कि बहुत अधिक है अत्यधिक फ्लोरोसेंट नमूना के साथ डिटेक्टर के संतृप्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इस सार्थक परिणाम के अधिग्रहण रोक सकता है. Autogain का प्रयोग करें (यदि आपके पाठक पर समर्थित) की सिफारिश नहीं है. एक औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन अपने परिणामों को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह विशेष रूप से उपयोगी है यह पहली बार जब आप इस परख चलाने है. नोट: यह अत्यंत महत्व का है कि सम्मिलित सिस्टम सही प्लेट मानचित्र का उपयोग करने के लिए पढ़ रहे हैं. लोड हो रहा है थाली नक्शे पर जानकारी के लिए बी.डी. www.bdbiosciences.com या संपर्क बी.डी. तकनीकी सहायता (labware@bd.com) पर तकनीकी बुलेटिन 436 सं देखते हैं. उचित प्लेट अभिविन्यास में अच्छी तरह A1 के साथ ऊपरी बाएँ कोने और BD flacon लोगो सही करने के लिए उन्मुख के रूप में प्लेट रीडर में डाला जाता है. </li></ol> डेटा कटौती डेटा के रूप में निम्नलिखित समीकरण में व्यक्त किया है: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="समीकरण" /> पृष्ठभूमि प्रतिशत सेल आक्रमण की गणना पहले घटाया जा सकता है RFU = रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों.

<ol>
	<li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol,+a+novel+triterpene,+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-&#922;B+activation.">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-&#x03BA;B-regulated gene products and TAK1-mediated NF-&#922;B activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li><li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-&#x03BA;B+Activation+by+Inhibiting+I&#x03BA;B&#x03B1;+Kinase+Activation,+Thereby+Suppressing+NF-&#x03BA;B-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression,+Up-regulating+Apoptosis,+and+Inhibiting+Invasion.">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-&#x03BA;B Activation by Inhibiting I&#x03BA;B&#x03B1; Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-&#x03BA;B-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li><li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+cysteini+residues+in+I&#x03BA;B&#x03B1;+kinase+and+NF-&#x03BA;B+(p65)+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells.">Modification of the cysteini residues in I&#x03BA;B&#x03B1; kinase and NF-&#x03BA;B (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-&#x03BA;B-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li><li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. e. g. u. e. l. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+Akt+Inhibitor,+Suppresses+I&#922;B&#945;+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-&#x03BA;B-Regulated+Gene+Expression,+Potentiation+of+Apoptosis,+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion.">an Akt Inhibitor, Suppresses I&#922;B&#945; Kinase Activation Leading to Suppression of NF-&#x03BA;B-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li><li>Partridge, J., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+High-Throughput+Screening+of+Tumor+Cell+Invasion+using+a+Cell-based+Model.">Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model.</a> Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+In+Vitro+Device+For+Measuring+Cell+Invasion+and+Method+for+its+Formation.">An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation.</a> US patent. , (2004).</li><li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds.">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li><li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds+by+a+Fluorescence+Based+Tumor+Invasion+Assay.">Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay.</a> Screentech 2001 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Quantitative,+High-Throughput+Assay+System+for+the+Discovery+of+Anti-Cancer+Drugs.">Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs.</a> Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. , (1999).</li></ol>

लेखकों बी.डी. बायोसाइंसेज कि इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और उपकरणों की उत्पादन के कर्मचारी हैं.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BD BioCoat Tumor Invasion System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354165 or 354166</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HT-1080 and NIH/3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351157 or 351158</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% Fetal Bovine Serum in DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Calcein AM Fluorescent Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354216 or 354217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks&#x2019; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an in vitro fluoroblok tumor invasion assay

metastatic कोशिकाओं की पहचान उनके तहखाने झिल्ली के माध्यम से आक्रमण और शरीर के अन्य भागों की ओर पलायन करने की क्षमता है. कक्ष दोनों छिपाना proteases कि नीचे तहखाने झिल्ली तोड़ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विस्थापित क्रम में आक्रामक होने के लिए सक्षम होना चाहिए. बी.डी. BioCoat ट्यूमर आक्रमण प्रणाली की स्थिति है कि उनके आक्रामक संपत्ति के मूल्यांकन की अनुमति के साथ कोशिकाओं को प्रदान करता है<em&gt; इन विट्रो में</em<sup1,2&gt;</sup&gt;. यह एक बी.डी. फाल्कन 24 multiwell FluoroBlok एक 8.0 माइक्रोन ताकना आकार पीईटी झिल्ली है कि समान बी.डी. Matrigel मैट्रिक्स के साथ लेपित किया गया है के साथ सम्मिलित प्लेट के होते हैं. बी.डी. Matrigel मैट्रिक्स की यह वर्दी परत एक पुनर्गठन तहखाने झिल्ली के रूप में कार्य करता है<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; गैर इनवेसिव कोशिकाओं के लिए एक सच्चे बाधा प्रदान करते हुए एक उपयुक्त प्रोटीन संरचना आक्रमण अध्ययन पेश. कोटिंग प्रक्रिया की झिल्ली pores occludes, झिल्ली के माध्यम से पलायन से गैर इनवेसिव कोशिकाओं को अवरुद्ध. इसके विपरीत, आक्रामक कोशिकाओं के लिए खुद से अलग और लेपित झिल्ली के माध्यम से विस्थापित करने में सक्षम हैं. सेल आक्रमण की quantitation DiIC के रूप में एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ या तो पूर्व या आक्रमण के बाद सेल लेबलिंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है<sub12&gt;</sub&gt; (3) या calcein AM, क्रमशः, और हमलावर कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति मापने. बी.डी. FluoroBlok झिल्ली के बाद से प्रभावी ढंग से&gt; 99% दक्षता पर 490-700 एनएम से प्रकाश के पारित होने के ब्लॉक, fluorescently लेबल कोशिकाओं है कि नहीं पर आक्रमण किया है एक नीचे पढ़ने प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक से पता नहीं कर रहे हैं. हालांकि, कोशिकाओं है कि झिल्ली के नीचे करने के लिए आक्रमण किया है अब कोई प्रकाश स्रोत से परिरक्षित हैं और संबंधित प्लेट पाठक के साथ पाया. यह वीडियो एक endpoint सेल आक्रमण परख दर्शाता है, का उपयोग calcein आक्रमण कोशिकाओं का पता लगाने AM.

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे को मापने के लिए सेल संस्कृति एक प्रतिदीप्ति आधारित पद्धति का उपयोग आवेषण के माध्यम से सेल आक्रमण.

एक इन विट्रो में FluoroBlok ट्यूमर आक्रमण परख

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

आसंजन और एस cerevisiae में अग्रवाल आक्रमण के लिए परख

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

तंत्रिका स्टेम सेल गतिशीलता का मूल्यांकन एक agarose जेल आधारित microfluidic युक्ति का प्रयोग

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

प्राथमिक माउस ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं और ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण परख के अलगाव

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

एक के अनुप्रयोग<em&gt; इन विट्रो में</emडीपीएस प्रोटीन का तनाव मध्यस्थता गुण कल्पना को&gt; डीएनए संरक्षण परख

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

जीन एक्सप्रेशन का डीएनए बातचीत, डिस्कवर transcriptional नियामकों, और उपन्यास विरोधी ट्यूमर एजेंटों की पहचान: प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक मात्रात्मक परख

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

इन विट्रो सेल प्रवास और आक्रमण assays में

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

वयस्क zebrafish में पार्श्व रेखा के उत्थान के लिए एक परख

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

इन विट्रो मेथिलिकरण परख में प्रोटीन Arginine मेथिलिकरण अध्ययन

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

इन विट्रो परख में phosphatidylethanolamine मिथाइल गतिविधि को मापने के लिए

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

इन विट्रो SUMOylation परख सूमो E3 Ligase गतिविधि का अध्ययन करने के लिए

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...