Name: an in vitro fluoroblok tumor invasion assay
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

После маркировки и измерения с использованием BD кальцеин AM флуоресцентного красителя Клетки помечены для количественного после того как они вторглись через BD Матригель Матрицы и пропускается через мембраны BD FluoroBlok. В результате, только конечная точка измерения клеточного вторжения могут быть получены. <ol><li> Расти клетки ~ 80% слияния. </li><li> Подготовка и увлажняет вставить системе. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Удалите пакет от -20 ° C хранения и дайте ему прийти к комнатной температуре. </li><li> Открытый пакет фольги и добавить 500 мкл теплой (37 ° C) СМИ интерьера вставки скважин. Разрешить пластину увлажняет в течение 2 часов при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Примечание: нет необходимости увлажняет немелованной BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставьте системы, которая будет использоваться в качестве контроля миграции клеток. </li><li> После регидратации, осторожно удалите среды от вставки скважин, не нарушая слой BD Матригель Матрица на мембране. Система готова к использованию. </li></ol></li><li> Подготовка клеточные суспензии по trypsinizing ячейки монослоев и ресуспендирования клеток в бессывороточной DMEM на 5 х 10 4 клеток / мл. Примечание: Если вы используете другой тип клеток необходимо определить оптимальную плотность посева. Для определения оптимальной плотности посева для вашего типа клеток на пористой поверхности роста, использование диапазона плотности посева (клеток / см 2), что скобки плотности посева используются на непористых поверхностях (например, фляги, блюда и тарелки). Например, если вы в настоящее время семена на уровне 2,5 х 10 5 клеток / см 2, семян при различных концентрациях между ячейками 5 × 10 4 и 5 х 10 5 клеток / см 2 для определения оптимальной начальной плотности посева. </li><li> Добавить 500 мкл клеточной суспензии (2,5 х 10 4 клеток) в апикальной камер. </li><li> Добавить 750 мкл хемоаттрактант (5% ЭТС в DMEM) к каждому из базального камеры, используя образец порты для доступа. </li><li> Инкубируйте опухоли BD BioCoat системы Вторжение и немелованной BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставьте пластины на 20-22 часов при 37 ° C, 5% СО 2 атмосферы. </li><li> После инкубации, осторожно удалите среды от апикальной камер. Это может быть достигнуто, вытряхнув содержимое в контейнер для отходов. Не прикасайтесь к нижней поверхности вставки системы. </li><li> Передача вставить системы во второй 24-луночного планшета, содержащую 500 мкл / лунку 4 мкг / мл кальцеин AM в HBSS. Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Решение кальцеин AM не удаляется из нижней палаты, прежде чем читать флуоресценции, потому что это жизненно nonfluorescent краситель, который превращается в зеленого флуоресцентного кальцеин по цитозольного эстераз. </li><li> Флуоресценция вторглись в клетках читается на длинах волн 494/517 нм (Ex / Ет) на дно чтения читатель флуоресцентные пластины. Установка усиления, возможно, должны быть определены эмпирически, но середина усиления должна быть достаточной отправной точкой. Установка усиления, что слишком высокая может привести к насыщению детектор с высокой флуоресцентные пробы; это может помешать приобретению значимых результатов. Использование AutoGain (если поддерживается вашим читателем) не рекомендуется. Перевернутой флуоресцентного микроскопа может быть использована для проверки ваших результатов, это особенно полезно, чтобы сделать это в первый раз вы запустите этот анализ. Примечание: Крайне важно, чтобы Вставить системы можно прочитать с помощью правильную карту пластины. Для получения информации о загрузке карты пластины видеть BD Технический бюллетень № 436 от www.bdbiosciences.com или свяжитесь с BD Техническая поддержка (labware@bd.com). Правильная ориентация пластина с хорошо A1 в левом верхнем углу и логотип BD Флакон ориентированных на право, как пластина вставляется в считыватель. </li></ol> Сжатие данных Данные выражается в следующей формуле: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="Уравнение" /> Фон может быть вычтен до расчета процентов вторжение ячейки РФС = относительная флуоресцентные единиц.

<ol>
	<li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol,+a+novel+triterpene,+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-&#922;B+activation.">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-&#x03BA;B-regulated gene products and TAK1-mediated NF-&#922;B activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li><li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-&#x03BA;B+Activation+by+Inhibiting+I&#x03BA;B&#x03B1;+Kinase+Activation,+Thereby+Suppressing+NF-&#x03BA;B-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression,+Up-regulating+Apoptosis,+and+Inhibiting+Invasion.">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-&#x03BA;B Activation by Inhibiting I&#x03BA;B&#x03B1; Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-&#x03BA;B-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li><li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+cysteini+residues+in+I&#x03BA;B&#x03B1;+kinase+and+NF-&#x03BA;B+(p65)+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells.">Modification of the cysteini residues in I&#x03BA;B&#x03B1; kinase and NF-&#x03BA;B (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-&#x03BA;B-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li><li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. e. g. u. e. l. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+Akt+Inhibitor,+Suppresses+I&#922;B&#945;+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-&#x03BA;B-Regulated+Gene+Expression,+Potentiation+of+Apoptosis,+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion.">an Akt Inhibitor, Suppresses I&#922;B&#945; Kinase Activation Leading to Suppression of NF-&#x03BA;B-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li><li>Partridge, J., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+High-Throughput+Screening+of+Tumor+Cell+Invasion+using+a+Cell-based+Model.">Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model.</a> Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+In+Vitro+Device+For+Measuring+Cell+Invasion+and+Method+for+its+Formation.">An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation.</a> US patent. , (2004).</li><li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds.">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li><li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds+by+a+Fluorescence+Based+Tumor+Invasion+Assay.">Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay.</a> Screentech 2001 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Quantitative,+High-Throughput+Assay+System+for+the+Discovery+of+Anti-Cancer+Drugs.">Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs.</a> Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. , (1999).</li></ol>

Авторы являются сотрудниками BD Biosciences, которая производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BD BioCoat Tumor Invasion System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354165 or 354166</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HT-1080 and NIH/3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351157 or 351158</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% Fetal Bovine Serum in DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Calcein AM Fluorescent Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354216 or 354217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks&#x2019; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an in vitro fluoroblok tumor invasion assay

Отличительной чертой метастатических клеток является их способность к вторжению через базальную мембрану и мигрировать в другие части тела. Клетки должны быть в состоянии и выделяют протеазы, которые расщепляют базальной мембраны, а также миграцию, чтобы быть агрессивным. BD BioCoat опухолевой инвазии Система обеспечивает клетки с условиями, которые позволяют оценить их инвазивных собственности<em&gt; В пробирке</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Она состоит из BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставить Тарелка с 8,0 микрон размер пор мембраны ПЭТ, которая была равномерно покрыта BD Матригель Matrix. Этот равномерный слой BD Матригель Матрица служит восстановленный базальной мембраны<em&gt; В пробирке</em&gt; Предоставление истинной барьер для неинвазивного клетки, представляя соответствующую структуру белка для изучения вторжения. Покрытие процесс закрывает поры мембраны, блокируя неинвазивных клетки мигрируют через мембрану. В отличие от инвазивных клетки способны отделяться от и мигрируют через покрытые оболочкой. Количественный клеточного вторжения может быть достигнуто либо пре-и пост-клеточного вторжения маркировки с флуоресцентным красителем, таких как DiIC<sub&gt; 12</sub&gt; (3) или кальцеин AM, соответственно, и измерения флуоресценции вторжения в клетки. Так как мембрана BD FluoroBlok эффективно блокирует прохождение света от 490-700 нм при&gt; 99% эффективности, флуоресцентно-меченых клеток, которые еще не вторглась не обнаруживаются снизу чтения флуоресценции читателя пластины. Однако клетки, которые вторглись на нижней мембраны уже не защищены от источника света и обнаружил с соответствующим читатель пластины. Это видео демонстрирует вторжения конечной точкой анализа клеточной, используя кальцеин утра до обнаружения вторжения клеток.

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

В этом видеоролике показано, как измерить ячейки вторжения через клеточные культуры вставками использованием флуоресценции основе методологии.

В пробирке FluoroBlok опухолевой инвазии Пробирной

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Анализ для адгезии и агар Вторжение в CEREVISIAE С.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Оценка подвижности нейронных стволовых клеток Использование агарозном геле основе микрожидкостных устройств

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Изоляция первичной мышь клетки трофобласта и анализа трофобласта Вторжение

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Применение<em&gt; В пробирке</em&gt; Защита ДНК Assay, чтобы визуализировать Стресс посредничеству свойствах белка Dps

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Количественный Анализ по изучению белок: ДНК взаимодействий, Discover транскрипционных регуляторов экспрессии генов, и идентифицировать новые противоопухолевых средств

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

В пробирке миграции клеток и Вторжение Анализы

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Анализ на боковой линии регенерации в взрослых данио рерио

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

В пробирке метилирования Пробирной по изучению белка аргинин метилирования

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Экстракорпоральное анализе измерить фосфатидилэтаноламина метилтрансферазы активность

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

В пробирке SUMOylation Assay для изучения сумо E3 лигаза активность

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...