Name: an in vitro fluoroblok tumor invasion assay
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

Post-märkning och mätning med hjälp av BD kalcein AM fluorescerande färg Celler är märkta för kvantifiering efter att de har invaderat genom BD Matrigel Matrix och passerade genom BD FluoroBlok membranet. Som ett resultat kan endast resultatmåttsmätningen av cell invasion erhållas. <ol><li> Grow celler till ~ 80% sammanflödet. </li><li> Förbered och återfuktar insatsen systemet. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Ta bort förpackningen från -20 ° C lagring och låt den komma till rumstemperatur. </li><li> Öppna folieförpackningen och lägga till 500 mikroliter varmt (37 ° C) media till det inre av insatsen brunnar. Låt plattan rehydrera i 2 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2. OBS: Det är inte nödvändigt att rehydrera obestruket BD Falcon FluoroBlok 24-multispot Sätt System som kommer att användas som en cell migration kontroll. </li><li> Efter rehydrering, försiktigt bort mediet från insatsen brunnar utan att störa lagret av BD Matrigel Matrix på membranet. Systemet är nu redo att använda. </li></ol></li><li> Förbered cellsuspensioner av trypsinizing cell monolager och resuspending cellerna i serumfritt DMEM på 5 x 10 4 celler / ml. Anm: Om du använder en annan celltyp du behöver för att fastställa den optimala sådd densitet. Att fastställa den optimala sådd densitet för din celltyp på en porös tillväxt yta, använd en rad seedning densitet (celler / cm 2) som parentes sådd densitet som används på nonporous ytor (dvs flaskor, fat och tallrikar). Till exempel, om du för närvarande utsädet på 2,5 x 10 5 celler / cm 2, utsäde vid olika cell-halter mellan 5 x 10 4 och 5 x 10 5 celler / cm 2 för att bestämma den optimala första sådd densitet. </li><li> Tillsätt 500 mikroliter cellsuspension (2,5 x 10 4 celler) till apikala kamrarna. </li><li> Tillsätt 750 mikroliter av chemoattractant (5% FBS i DMEM) till envar av de basala kamrarna, med hjälp av prov portar för åtkomst. </li><li> Inkubera BD BioCoat System tumör Invasion och obestruket BD Falcon FluoroBlok 24-multispot Sätt tavla i 20-22 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2 atmosfär. </li><li> Efter inkubation, försiktigt bort mediet från den apikala kamrarna. Detta kan uppnås genom att ställa innehållet i en avfallsbehållare. Rör inte bottenytan av insatsen systemet. </li><li> Överför in systemet i en andra 24-brunnar innehåller 500 mikroliter / brunn av 4 mikrogram / ml kalcein AM i HBSS. Inkubera 1 timme vid 37 ° C, 5% CO 2. Den kalcein AM Lösningen är inte bort från den nedre kammaren innan du läser fluorescens eftersom det är en nonfluorescent viktigt färgämne som omvandlas till grönt fluorescerande kalcein av cytosoliska esteraser. </li><li> Fluorescens invaderade celler läses vid våglängderna 494/517 nm (Ex / Em) på en botten behandlingen fluorescerande plattläsaren. Vinsten inställning kan behöva bestämmas empiriskt, men en mittpunkt vinst bör vara ett tillräckligt utgångspunkt. En vinst inställning som är för hög kan leda till mättnad av detektorn med mycket fluorescerande provet, detta kan förhindra förvärv av meningsfulla resultat. Användning av AutoGain (om det stöds av din läsare) rekommenderas inte. Ett inverterat fluorescensmikroskop kan användas för att verifiera dina resultat, det är framförallt bra att göra detta första gången du kör denna analys. OBS: Det är av yttersta vikt att Infoga Systems läses med rätt platta kartan. För information om hur du fyller tallriken kartor se BD Teknisk Bulletin No 436 på www.bdbiosciences.com eller kontakta BD teknisk support (labware@bd.com). Rätt platta inriktning är med väl A1 i övre vänstra hörnet och BD flacon logotyp orienterade åt höger plattan sätts in i läsaren. </li></ol> Datareduktion Data är uttryckt i följande ekvation: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="Ekvation" /> Bakgrund kan dras av före beräkningen av procent cell invasion RFU = relativt fluorescerande enheter.

<ol>
	<li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol,+a+novel+triterpene,+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-&#922;B+activation.">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-&#x03BA;B-regulated gene products and TAK1-mediated NF-&#922;B activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li><li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-&#x03BA;B+Activation+by+Inhibiting+I&#x03BA;B&#x03B1;+Kinase+Activation,+Thereby+Suppressing+NF-&#x03BA;B-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression,+Up-regulating+Apoptosis,+and+Inhibiting+Invasion.">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-&#x03BA;B Activation by Inhibiting I&#x03BA;B&#x03B1; Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-&#x03BA;B-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li><li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+cysteini+residues+in+I&#x03BA;B&#x03B1;+kinase+and+NF-&#x03BA;B+(p65)+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-&#x03BA;B-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells.">Modification of the cysteini residues in I&#x03BA;B&#x03B1; kinase and NF-&#x03BA;B (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-&#x03BA;B-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li><li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. e. g. u. e. l. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+Akt+Inhibitor,+Suppresses+I&#922;B&#945;+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-&#x03BA;B-Regulated+Gene+Expression,+Potentiation+of+Apoptosis,+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion.">an Akt Inhibitor, Suppresses I&#922;B&#945; Kinase Activation Leading to Suppression of NF-&#x03BA;B-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li><li>Partridge, J., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+High-Throughput+Screening+of+Tumor+Cell+Invasion+using+a+Cell-based+Model.">Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model.</a> Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+In+Vitro+Device+For+Measuring+Cell+Invasion+and+Method+for+its+Formation.">An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation.</a> US patent. , (2004).</li><li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds.">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li><li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds+by+a+Fluorescence+Based+Tumor+Invasion+Assay.">Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay.</a> Screentech 2001 Conference. , (2005).</li><li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Quantitative,+High-Throughput+Assay+System+for+the+Discovery+of+Anti-Cancer+Drugs.">Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs.</a> Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. , (1999).</li></ol>

Författarna är anställda av BD Biosciences som producerar reagenser och verktyg som används i denna artikel.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BD BioCoat Tumor Invasion System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354165 or 354166</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HT-1080 and NIH/3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351157 or 351158</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% Fetal Bovine Serum in DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Calcein AM Fluorescent Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354216 or 354217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks&#x2019; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>351147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an in vitro fluoroblok tumor invasion assay

Det kännetecknande för metastaserande celler är deras förmåga att invadera igenom basalmembranet och migrera till andra delar av kroppen. Cellerna måste kunna både utsöndra proteaser som bryter ner basalmembranet samt migrera för att vara invasiva. BD BioCoat tumör Invasion System ger celler med villkor som möjliggör bedömning av deras invasiva egendom<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Den består av en BD Falcon FluoroBlok 24-multispot Sätt tavla med ett 8,0 micron porstorlek PET-membran som har varit jämnt belagda med BD Matrigel Matrix. Denna enhetliga lager av BD Matrigel Matrix fungerar som en rekonstruerad basalmembran<em&gt; In vitro</em&gt; Ger en sann hinder för icke-invasiva celler medan presenterar en lämplig proteinstruktur att studera invasion. Beläggningen processen occludes porerna i membranet, blockera icke-invasiva celler från vandrar genom membranet. Däremot invasiva celler kan lösgöra sig från och vandrar genom den belagda membranet. Kvantifiering av cell invasion kan uppnås genom att antingen före eller efter-cells invasionen märkning med en fluorescerande färg som DiIC<sub&gt; 12</sub&gt; (3) eller kalcein AM respektive och mäta fluorescens invaderande celler. Eftersom BD FluoroBlok membranet effektivt blockerar passagen av ljuset från 490 till 700 nm vid&gt; 99% effektivitet, fluorescerande-märkta celler som inte har invaderat inte upptäcks av en bottom-läsning fluorescens plattläsaren. Däremot är celler som har invaderat på undersidan av membranet inte längre skyddade från ljuskällan och detekteras med respektive plattläsaren. Denna video visar en slutpunkt analys cell invasion, med hjälp av kalcein AM för att upptäcka invaderade celler.

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay at JoVE.com

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Denna video visar hur man kan mäta cell invasion genom insatser cellodling med hjälp av en fluorescens-baserad metod.

En In vitro FluoroBlok tumör Invasion analys

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Analys för vidhäftningsförmåga och agar Invasion i S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Bedöma Neurala Motility Stem Cell Använda en agarosgel-baserade mikroflödessystem enhet

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolering av primära celler Mus trofoblaster och trofoblaster Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Applicering av en<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Protection Assay att visualisera Egenskaper Stress medling Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

En kvantitativ analys för att studera protein: DNA-interaktioner, Discover transkriptionsregulatorer av genuttryck, och identifiera nya antitumörmedel

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration och Invasion Analyser

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

En analys för sidolinje Regeneration i vuxen Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Metylering analys för att studera protein Arginin Metylering

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In vitro-analys för att mäta Fosfatidyletanolamin Methyltransferase aktivitet

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay att studera SUMO E3 Ligase aktivitet

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...