Name: method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

Arbetet stöddes av NIH bidrag AI57159 (till SCH) och AI72346 (till AMvO). SCH är en Howard Hughes Medical Institute Investigator.

Skyddsglas slip funktionalisering Den plana tvåskiktsmembran används i fusion-analysen ligger på ett hydrerad film av dextran. Dextran fungerar som en distans mellan den plana tvåskiktsmembran och glasytan. Detta förhindrar membran komponenter från fastna på glasytan och ger också utrymme till vilka innehållet i ett virus partikel kan fly vid fusion. Glas täckglas är functionalized genom behandling med en epoxi silan, vilket ger oss möjlighet att kemiskt band dextran mot glaset (El...

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Beredning av vätska och kontinuerligt stöd bilayers fett kan vara en utmaning. Spårmängder av kontaminerande material eller ytdefekter kommer att förhindra spridning av bilayers. Noggrann rengöring och deponering av ett enhetligt lager av dextran är viktiga. Långvarig avbildning av viruspartiklar kan bleka fluorescerande etiketter eller orsaka dem att bli inaktiverat. Bild-skador av detta slag är välkänt i bio-imaging och enda fält molekyl och är allmänt tros härröra från ge...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

Membran fusion är ett viktigt steg vid införandet av höljeförsedda virus in i cellerna. Konventionella fusion analyser rapport vanligtvis på ett stort antal av fusion händelser, gör det svårt att kvantitativt analysera sekvensen av de inblandade molekylära steg. Vi har utvecklat en in vitro, tvåfärgad fluorescens-analysen för att övervaka kinetik av enstaka viruspartiklar fixering med ett mål tvåskiktsmembran på huvudsakligen vätska stöd. Influensa viruspartiklar inkuberas med en grön lipofil fluoroforen att färga membranet och en röd hydrofil fluoroforen att färga den virala interiör. Vi deponera en ganglioside innehåller membranet på dextran-functionilized glasytan ett flöde cell, Inkubera viruspartiklar på plana tvåskiktsmembran och bild fluorescens av en 100 x 100 ìm 2-området, som innehåller flera hundra partiklar på en CCD kameran. Genom imaging både röda och gröna fluorescens, kan vi övervaka samtidigt beteende membranet färg (grön) och vattenfasen innehåll (röd) av partiklarna. Vid sänkning av pH till ett värde som underskrider den fusion pH, kommer partiklarna säkring med membranet. Hemifusion, en sammanslagning av den yttre bipacksedel virala membran med den yttre bipacksedel målet membranet, kommer att synas som en plötslig förändring i grön fluorescens av en partikel. Vid den efterföljande fusion av de två återstående distala flygblad en por kommer att bildas och den röda som avger fluoroforen i det virala partiklar kommer att släppas under målet membranet. Denna händelse kommer att leda till en minskning av röda fluorescens av enskilda partiklar. Slutligen, rapporterar den integrerade fluorescens från ett pH-känsligt fluoroforen som är inbäddat i målet membranet på den exakta tiden för pH-värdet sjunker. Från de tre fluorescens-time spår, kan alla viktiga händelser (pH-värdet sjunker, lipid blandning på hemifusion, innehåll blandning på porbildning) nu hämtas på ett enkelt sätt och för varje partikel individuellt. Genom att samla förfluten tid för de olika övergångar för många enskilda partiklar i histogram, kan vi bestämma livslängd för motsvarande intermediärer. Även dolda intermediärer som inte har en direkt fluorescerande observerbart kan visualiseras direkt från dessa histogram.

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Vi presenterar ett<em&gt; In vitro,</em&gt; Två färger fluorescens analys för att visualisera fusion av enstaka viruspartiklar med en vätska mål tvåskiktsmembran. Genom märkning viruspartiklar med fluoroforer att differentiellt fläcken virusets membran och dess interiör, kan vi övervaka kinetik hemifusion och porbildning.

Metod för mätning av Viral Fusion Kinetics på enskild partikel nivå

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Enda partikel elektronmikroskopi Rekonstruktion av Exosome Complex Använda Random Konisk Tilt metod

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Att mäta kinetiken av mRNA-transkription i enskilda levande celler

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studera Proteolys av cyklin B på den inre cellnivå i hela cellpopulationer

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analys av LINE-1 retrotransposition på den inre Nucleus nivå

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avancerad konfokalmikroskopi tekniker för att studera Protein-protein interaktioner och kinetik på DNA lesioner

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel och effektiv Administration och visualisering av mikropartiklar i cirkulationssystemet av små fiskar använder njure injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analys av Beta-cell-funktion som använder Single-cell Resolution kalcium Imaging i zebrafiskar holmar

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Visualisera samspelet mellan Qdot-märkt Protein och anläggningsvis modifierade λ DNA på nivån enda molekyl

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...