Name: visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00
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Nous reconnaissons les dons en nature des souches bactériennes à partir des groupes du professeur Judith Armitage (Université d&#39;Oxford, Royaume-Uni) et le professeur Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London, UK). IMD est financé conjointement par le Département de biochimie (Université d&#39;Oxford) et OCISB; AR est financé par une ingénierie et sciences physiques Research Council (EPSRC) stagiaire de DTC; ND est financé à partir des biotechnologies et des sciences biologiques du Conseil de recherches (BBSRC); MCL est financée par une bourse de la Société royale de recherche universitaire.

<ol><li> Pour commencer cette procédure, 50 pl de stocks congelés de la protéine fluorescente Escherichia coli exprimant les cellules bactériennes sont d&#39;abord décongelée et culture aérobie avec agitation dans 5 ml de milieu LB de croissance nuit à 37 ° C. Dans la matinée, 50 pi de cette culture saturée est extrait et sous-culture dans les milieux de culture minimale M63 glucose, l&#39;incubation à 30 degrés C pendant 4 à 6 heures. Ici nous démontrons l&#39;aide de deux souches de cellules différentes, dont l&#39;un...

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	<li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging.">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay.">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay.">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane.">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane.">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential,+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli.">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells.">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li></ol>

Des précautions doivent être prises pour ne pas «plus de cisaillement&quot; cellule pour regarder les bactéries attachées, car cela pourrait nuire à la fonctionnalité des moteurs flagellaires. Il est important d&#39;utiliser des cellules pour beaucoup plus d&#39;une heure une fois sur la lame du microscope, car ils peuvent devenir pauvre en oxygène. Optimisation considérables peuvent être nécessaires pour trouver les meilleurs conditions d&#39;imagerie microscope traiteur à votre système biologique spécifi...

visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy

Aperçu complet sur les mécanismes de cellules vivantes peuvent être atteints que par l&#39;étude des processus clés qui déclenchent et direct d&#39;événements au niveau cellulaire. À ce jour, la complexité des systèmes biologiques de cisaillement a provoqué précise molécule unique d&#39;expérimentation à être beaucoup trop exigeant, de se concentrer plutôt sur des études de systèmes simples à l&#39;aide en vrac relativement rudimentaires ensemble de la moyenne des mesures. Toutefois, plusieurs processus importants se produisent dans la cellule vivante, au niveau d&#39;un seul ou de quelques molécules; mesures d&#39;ensemble masque généralement la nature stochastique et hétérogène de ces événements. Ici, en utilisant la microscopie optique de pointe et d&#39;analyse des outils d&#39;analyse d&#39;image, nous démontrons comment surveiller les protéines au sein d&#39;une seule cellule vivante bactérienne avec une précision de molécules uniques et comment nous pouvons observer la dynamique au sein de complexes moléculaires dans le fonctionnement des machines biologiques. Les techniques sont directement pertinents physiologiquement. Ils sont peu-perturbatifs et non-invasive à l&#39;échantillon biologique à l&#39;étude et sont entièrement à l&#39;écoute pour des recherches dans la matière vivante, les fonctionnalités ne sont pas facilement disponibles pour les autres une seule molécule des approches de biophysique. En outre, les échantillons biologiques étudiés tous les produits de protéines par fluorescence marqués à des niveaux qui sont presque identiques aux souches de cellules non modifiées («codage» génomique), par opposition à l&#39;approche la plus commune, mais moins idéal pour générer des protéines beaucoup plus que ne se produisent naturellement («plasmide d&#39;expression»). Ainsi, les échantillons biologiques réelles qui seront étudiés sont beaucoup plus près les organismes naturels, et donc la plus pertinente pour les observations réelles des processus physiologiques.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Ici nous démontrons les protocoles pour effectuer une seule molécule de microscopie par fluorescence sur des cellules vivantes pour permettre aux bactéries fonctionnelles complexes moléculaires à détecter, suivre et quantifiés.

Visualisation simple complexes moléculaires In Vivo Utilisation avancée de microscopie par fluorescence

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Research

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Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

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Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

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Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

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Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

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Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

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