Name: visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00
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我々は教授ジュディスアーミテージ（オックスフォード大学、英国）と教授コンラッドMullineaux（ロンドンのクイーンメアリー大学、英国）のグループから、菌株の種類の寄付を認める。 IMDは、共同で生化学の部門（オックスフォード大学）とOCISBによって資金を供給され、ARは、工学物理科学研究評議会（EPSRC）DTCの学生の身分によって資金を供給され、NDは、バイオテクノロジーおよび生物科学研究会議（BBSRC）から資金提供され、MCLは王立協会大学研究フェローシップによって資金を供給。

<ol><li>この手順を開始するには、 大腸菌の細菌細胞を発現する蛍光蛋白質の凍結ストックの50μlを最初に解凍し、午前中は37℃で一晩5 mlのLB培養培地で振盪しながら好気的に栽培されている、この飽和文化の50μlを抽出し、 、最小のM63グルコースの培地へと継代培養4〜6時間、30℃でインキュベートする。ここでは、電子輸送を表現するそのうちの一つ、2つの異なる細胞株を、使用例を示すGFP、GFPと融合?...

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	<li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging.">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay.">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay.">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane.">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane.">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential,+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli.">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells.">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li></ol>

これは、べん毛モーターの機能を損なうおそれがあるので注意が、つながれた細菌を調べるための細胞&quot;せん断を介して&quot;しないように注意する必要があります。彼らは酸素枯渇になる可能性があるので、顕微鏡スライド上に、1時間に1回よりもはるかに長いためにセルを使用することが重要です。かなりの最適化は、最適な顕微鏡の撮像条件が検討され、特定の生物学的システムへの?...

visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy

生きた細胞のメカニズムへの完全な洞察は、細胞レベルでの事象を惹起し、ダイレクトキープロセスを調べることによってのみ達成することができます。生物系のせん断複雑さをこれまでには、代わりに相対的に原油バルクアンサンブル平均測定を使用して単一システムの研究に焦点を当て、あまりにも要求される正確な単一分子実験を引き起こしている。しかし、多くの重要なプロセスは一つのレベルで生きている細胞や少数の分子で起こる、アンサンブルの測定値は、一般的にこれらのイベントの確率と異種の性質を覆い隠す。ここでは、高度な光学顕微鏡と我々は、単一の分子とどのように我々は生物学的機械の機能に分子複合体内動態を観察できるの精度への単一の生きた細菌細胞内のタンパク質を監視する方法を示す分析画像解析ツールを使用して。テクニックは、生理学的に直接関連しています。彼らが検討されて生体試料に最小限の摂動と非侵襲的であり、完全に生体を構成する物質の調査、生物物理学の他の単一分子のアプローチが容易に利用できない機能に同調されています。さらに、生物学的標本は、すべて自然に発生するよりもはるかに多くのタンパク質を生成するための、より一般的ですが、理想的なアプローチとは対照的に変更されていない細胞株（&quot;ゲノムエンコード&quot;）とほとんど同一のレベルで、少なくとも蛍光タグタンパク質を生成する研究（&quot;発現プラスミド&quot;）。このように、調査される実際の生物学的サンプルは、自然の生物にかなり近いですので、実際の生理学的プロセスへの観察は、より関連性の高い。

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

生物学

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

生体共焦点顕微鏡を用いてリンパ節構造と細胞局在化を可視化

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...