Name: visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Vi erkänner den typ donationer av bakteriestammar från grupper av Prof. Judith Armitage (University of Oxford, Storbritannien) och professor Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London, Storbritannien). IMD finansieras gemensamt av Institutionen för biokemi (Oxford University) och OCISB, AR finansieras av en Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) DTC utbildningsbidrag, ND finansieras från bioteknik och Biological Sciences Research Council (BBSRC), MCL är finansieras av en Royal Society University Research Fellowship.

<ol><li> Till att börja den här proceduren är 50 l fryst lager av fluorescerande proteinet uttrycka Escherichia coli bakterieceller first tinas och vuxit aerobt med skakning i 5 tillväxt ml LB media över natten vid 37 grader C. På morgonen är 50 l av denna mättade kultur extraherade och sub-odlade i minimal M63 media glukos kultur, inkubering i 30 grader C i 4 till 6 timmar. Här visar vi två olika cell-stammar, av vilka uttrycker en elektron-transport cytokrom smält till GFP, den andra som uttrycker ett protein som deltar i ...

<ol>
	<li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging.">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay.">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay.">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane.">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane.">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential,+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli.">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells.">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li></ol>

Man måste vara försiktig att inte &quot;över shear&quot; cell för att titta på bundna bakterier, eftersom detta kan försämra funktionaliteten hos flagellar motorer. Det är viktigt att använda celler för mycket längre än en timme en gång på objektglas eftersom de kan bli syrefattigt. Betydande optimering kan krävas för att hitta den bästa mikroskopet avbildning villkor tillgodoses dina specifika biologiska systemet under utredning. Det kan vara klokt att försöka sig på avbildning med renat GFP ensam a...

visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy

Full insyn i de mekanismer i levande celler kan endast uppnås genom att undersöka viktiga processer som framkallar och direkta händelser på cellnivå. Hittills skjuvning komplexiteten i biologiska system har orsakat exakt enda molekyl experiment för att vara alltför krävande, i stället för att fokusera på studier av enskilda system som använder relativt grova bulk ensemble-genomsnittet mätningar. Men många viktiga processer sker i den levande cellen i nivå med bara en eller ett fåtal molekyler, ensemble mätningar generellt maskera stokastiska och heterogena dessa händelser. Här med hjälp av avancerad optisk mikroskopi och analytiska bild analysverktyg vi visar hur man kan övervaka proteiner i en enda levande bakterie med en precision av enstaka molekyler och hur vi kan observera dynamiken inom molekylär komplex i fungerande biologiska maskiner. De tekniker som är direkt relevanta fysiologiskt. De är minimalt perturbative och icke-invasiv till biologiskt prov som undersöks och är fullt anpassad för utredningar i levande material, funktioner som inte är tillgängliga för andra en-molekyl strategierna i biofysik. Dessutom studerade biologiska prover alla producerar fluorescerande-märkta proteinet på nivåer som är nästan identiska med omodifierade celler stammar (&quot;genomisk kodning&quot;), i motsats till den vanligare men mindre bra metod för att generera betydligt mer protein än vad som förekommer naturligt (plasmid uttrycket &quot;). Således, den verkliga biologiska prover som kommer att undersökas är betydligt närmare den naturliga organismer, och därför iakttagelser mer relevanta för verkliga fysiologiska processer.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Här kan vi visa protokoll för att utföra en enda molekyl fluorescensmikroskopi på levande bakterieceller att funktionella molekylära komplex som ska upptäckas, spåras och kvantifieras.

Visualisering Singel molekylkomplex In Vivo Använda avancerade fluorescensmikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualisera enda molekyl DNA-replikering med fluorescensmikroskopi

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualisering Bakterier i Nematoder med fluorescensmikroskopi

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analys av Autophagy med Advanced 3D Fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snabb analys och utforskningen av fluorescensmikroskopi bilder

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule frekvens med fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Funktionell avbildning av Viral transkription fabriker använder 3D fluorescensmikroskopi

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualisera lymfkörtel struktur och cellulär lokalisering med ex-vivo konfokalmikroskopi

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersökning av mitotiska och Meiotic fission jäst nukleär dynamik genom fluorescens Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...