Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

作者想感谢他们的合作和后勤支持，罗马大学“的Tor Vergata”分析化学实验室南希唐纳和所有成员。这项工作是支持由欧盟项目“BioCop”。

1）阻塞包被的磁珠： 继续如下块包被的磁珠： <ol><li>准备一个2毫升Eppendorf管; </li><li>均质（摇晃，但没有涡旋）包被的磁珠（见附录准备包被的磁珠）使用样品旋转的搅拌机; </li><li>紧随之后，同质化，移液器10μL到每个单独的Eppendorf管包被的磁珠; </li><li>添加脱脂阻止到Eppendorf管中设置的每个解决方案的牛奶1毫升; </li><li>让我们为在室温下30分钟孵育旋转样品混合器磁珠; </l...

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

利用抗体作为生物分子识别探头已经出现了遥感技术的广泛使用;免疫组织化学检测方法，如酶联免疫吸附和MEIAs，时下许多实验室 7中最常用和应用平台之间， 。 虽然这些方法在过去几年中实现特殊的敏感性和特异性，许多研究小组的主要目标，已被其表演的改进和优化。 在这个协议中，我们已经展示了如何编造并询问霉菌毒素的检测的电化学?...

试剂<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论（可选） </td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>西格玛</td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>西格玛</td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>西格玛</td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>西格玛</td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2的无水</td><td>西格玛</td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA（99.5％） </td><td>西格玛</td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCL 37％ </td><td>西格玛</td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td>西格玛</td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基]氨基甲烷</td><td>西格玛</td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA（牛血清白蛋白） </td><td>西格玛</td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>西格玛</td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td>吐温20 </td><td>西格玛</td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td>为NaN 3 </td><td>爱秩序</td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - 萘基磷酸二钠</td><td> Fluka公司</td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td>脱脂牛奶封闭液 - 非脱脂奶粉</td><td> Bio - Rad公司</td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT - 2共轭与KLH（匙孔戚血蓝蛋白），储备溶液（1毫克/毫升的PBS）： </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> HT - 2 - KLH偶联物，得到了由N，N&#39; -羰基（​​CDI）和激活的HT - 2毒素，激活位置3和4的HT - 2毒素的OH - CDI方法让反应蛋白（KLH）aminogroups产生一个稳定的carbammate联动。 </td></tr><tr><td>二次标记抗体：从马抗小鼠IgG（H + L），碱性磷酸酶标记，浓度为1毫克/毫升。 </td><td>媒介实验室</td><td> AP - 2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT - 2毒素</td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁珠磁珠® </td><td> DYNAL </td><td> M - 280 Tosylactivated </td><td>浓度为2 × 10 9粒/毫升。 </td></tr></table>解决方案<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 试剂名称 </td><td> 制备 </td><td> 评论（可选） </td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH值7.4 </td><td>氯化钾0.20克，0.20克磷酸二氢钾，磷酸氢二钠1.16克和8.00克氯化钠溶解在900毫升的水</td><td></td></tr><tr><td>二乙醇胺缓冲液，DEA，0.97中号+ 1毫米氯化镁2 + 0.15 M氯化钾，pH值9.8 </td><td> MgCl 2的无水，氯化钾和59年3月7日克〜300毫升的水溶解0.0476克。解散后，添加51毫升的DEA（99.5％）。调节pH值至9.8，用盐酸（6米）。与水稀释至500毫升。 </td><td></td></tr><tr><td>硼酸盐缓冲液，pH值9.5，0.1 M </td><td> H 3 BO 3〜300毫升的蒸馏水溶解3.09克;用NaOH和/或盐酸（6米或低浓度）的pH值调整至9.5。用蒸馏水稀释至500毫升。 </td><td></td></tr><tr><td> TRIS缓冲液，0.2 M，pH值8.5 </td><td>三羟甲基]在100毫升的水基氨基甲烷溶解3.85克。用NaOH和/或盐酸（6米或低浓度），调整pH至8.5。与水稀释至200毫升。 </td><td></td></tr><tr><td> TRIS缓冲液+ BSA溶液（0.1％），pH值8.4 </td><td>溶解在50毫升的Tris缓冲液pH值8.4的牛血清白蛋白的0.050克。 </td><td>这个解决方案必须使用当天新鲜配制。 </td></tr><tr><td> PBS缓冲液+吐温® 0.05％ </td><td>吐温20克溶解在500毫升先前准备的PBS缓冲液，pH值7.4 0.250 </td><td></td></tr><tr><td> PBS缓冲液+ BSA溶液0.1％ </td><td>溶解在50毫升的PBS缓冲液，pH值7.3的牛血清白蛋白的0.050克。 </td><td>这个解决方案必须使用当天新鲜配制。 </td></tr><tr><td> PBS缓冲液+ BSA 0.1％+南安3 0.02％ </td><td> BSA和NaN的3 0.010 0.050克溶解在50毫升的PBS缓冲液，pH值7.3。 </td><td>存储溶胶ution </td></tr><tr><td>酶法基板</td><td> 0.010克，1 - 萘磷酸钠盐溶解在100毫升的DEA缓冲液pH值9.8。铝箔紧紧包裹烧瓶。 </td><td>这个解决方案必须使用当天新鲜配制。 </td></tr><tr><td>脱脂牛奶封闭液</td><td>加入0.20克印迹级拦截器非脱脂奶粉（BIO - RAD，大力神，加利福尼亚，美国），以200毫升的PBS缓冲液pH值7.3。 </td><td>这个解决方案必须使用当天新鲜配制。 </td></tr><tr><td> HT - 2原液</td><td>溶解的单端孢HT - 2毒素小瓶10毫克，10毫升的乙腈给 与浓度为1毫克/毫升的解决方案。 </td><td>分割成30毫升的一次性使用的等分这一解决方案，并储存在低于-30 ° C </td></tr><tr><td> HT - 2工作标准溶液</td><td>移液器HT - 2毒素原液20毫升到2毫升校准容量瓶中，用乙腈稀释，以获得一个HT - 2的溶液中含有10微克/ ml的单端孢毒素。 </td><td>这个解决方案应该使用当天新鲜配制。 </td></tr><tr><td> HT - 2校准解决方案</td><td>稀释的HT - 2工作标准溶液（10微克/毫升）准备工作校准解决方案，100毫微克/毫升。稀释HT - 2的工作校准解决方案，100 ng / ml的准备工作以下浓度0（空白），0.5，1，2，4，10毫微克/毫升的校准解决方案。 </td><td>这些解决方案都必须准备使用当天新鲜。 </td></tr><tr><td> HT - 2共轭与KLH </td><td>分裂与KLH（匙孔戚血蓝蛋白）储备溶液（1毫克/毫升的PBS）HT - 2的共轭到350μL的一次性使用的等分。 </td><td>在-30 ° C店等分</td></tr><tr><td>特异性单克隆抗体</td><td>稀释1:350（V：V）的股票在PBS的浓度（1.383毫克/毫升）单克隆抗体的使用在竞争中一步</td><td>在使用的时候，这个解决方案必须准备新鲜。 10毫升的PBS抗体股票最终体积为3.5毫升的解决方案，足以分析17标准和/或样品。 </td></tr><tr><td>中学标记抗体</td><td>抗小鼠IgG（H + L）与碱性磷酸酶标记是1:100（V：V）的PBS稀释到使用在竞争中的一步。 </td><td>在PBS 100μL抗体股票最终体积为10毫升的解决方案，足以分析25标准和/或样品。在使用的时候，这个解决方案必须准备新鲜。 </td></tr></table>仪器<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 评论（可选） </td></tr><tr><td>磁粉浓缩：MPC ® - S </td><td> DYNAL </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens仪器</td><td> PalmSens </td><td>提供PalmSens建兴，串行电缆连接电脑笔记本电脑和软件复用器选项</td></tr><tr><td> CH8 PalmSens复用器</td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td>八通道MUX电接点</td><td>手工制作</td><td></td></tr><tr><td>地带与八个丝网印刷电极（SPES） </td><td>手工制作</td><td></td></tr><tr><td>特殊设计的电极地带的支持</td><td>手工制作</td><td>每个是放在下面的每一个工作电极表面的SPE包括8钕磁铁</td></tr><tr><td>校准微升移液器</td><td>吉尔森</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器，搅拌棒。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧杯（100，50，20毫升）。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>容量瓶（2毫升）。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2和2毫升Eppendorf管。 </td><td> Eppendorf公司</td><td></td></tr><tr><td>猎鹰™管各5ml15毫升。 </td><td>鹘</td><td></td></tr><tr><td>实验室旋涡混合器</td><td></td><td>不要使用旋涡混合器重悬磁珠涂HT2 - KLH或联系，以避免proteic部分变性与免疫链</td></tr><tr><td>实验室烘箱或恒温室</td><td></td><td>选择一个烤箱能够保持温度为37 ± 3 ° C。 </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

免疫分析是一种有效的替代更昂贵和时间耗费定量高效液相色谱法或气相色谱1，2为食品类商品中的有害霉菌毒素的筛选检测方法。在这个协议中，我们将展示如何编造并询问电化学竞争性酶联酶联免疫检测，基于磁珠免疫组织化学链 3和丝网印刷电极感应平台的坚实支持。 我们的方法旨在确定总额的HT - 2和T - 2毒素，霉菌毒素属于trichothecenes家庭和 4对人类健康的极大关注。使用了对HT - 2和T - 2的100％的交叉反应的抗体克隆允许同时检测两种毒素具有相似的灵敏度5。 我们检测的第一步是涂层的步骤，我们固定在磁珠表面HT2 - KLH偶联物毒素。后阻塞的一步，要避免非特异性吸收，另外一种单克隆抗体，使固定HT - 2和自由的HT - 2或T - 2样品中或溶解在一个标准的解决方案之间的竞争。 在年底的竞争一步，单克隆抗体的数量挂钩的固定HT - 2将样品溶液中的毒素量成反比。 碱性磷酸酶（AP）标记二抗是用来揭示之间的特异性抗体和固定的HT - 2的结合。最终的测量步骤是下降磁珠悬液等分的，对应一个特定的样品/标准的解决方案，一个丝网印刷工作电极表面上;磁珠固定和集中划归正是磁铁丝网印刷电极。经过两分钟的孵化磁珠和一个AP的基板之间，酶产品检测微分脉冲伏安法（DPV）使用便携式仪器（PalmSens）也能够启动几秒钟的时间间隔内自动八个测量。

Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

检测trichothecenes（霉菌毒素对人类健康的关注），使用一种新开发的筛查方法的基础上有竞争力的免疫组织化学方法和最后的电化学检测的一个协议证明。

ELIME霉菌毒素的检测方法（酶联免疫磁电化学）

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

蛋白泛素化的检测

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

科研

生物学

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

由不稳定的多蛋白质复合物的分离在体内控制细胞的交联和免疫磁性亲和层析

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

N -连接糖链的糖蛋白在哺乳动物细胞中的脉冲大通分析

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

利用磁调制生物传感系统的生物检测的快速均质检测

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

醋酸形成醋酸酶激酶活性的直接检测

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

作为寄主植物挥发物的筛选工具electroantennographic生物活性

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

定量PCR是用于检测巨细胞病毒DNA在福尔马林固定，石蜡包埋的活检组织一个灵敏快速的方法

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

多酶筛选使用高通量基因酶的筛选系统

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

使用洗涤剂和酶无酶方法从整个组织进行核分离

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

用组织培养幼苗制备和饲养轴性昆虫用于叶甲虫的宿主 - 肠道微生物群相互作用研究

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...