Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

Auteurs willen graag Nancy Downer en alle leden bedanken uit het laboratorium van de Analytische Chemie, Universiteit van Rome &quot;Tor Vergata&quot; voor hun samenwerking en logistieke ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het EU-project &quot;BioCop&quot;.

1) Het blokkeren van gecoate magnetische Beads: Ga als volgt te gecoate magnetische kralen te blokkeren: <ol><li> Bereid een set van 2 ml Eppendorf buizen; </li><li> Homogeniseer (schudden, maar niet vortexen) gecoate magnetische kralen (zie de bijlage voor de bereiding van gecoate magnetische korrels) met behulp van het monster draaiende mixer; </li><li> Onmiddellijk na homogenisering, pipet 10 ul van gecoate magnetische korrels in elk afzonderlijk Eppendorf buizen; </li><li> Voeg 1 ml mager...

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

Het gebruik van antilichamen als biomoleculaire erkenning probe heeft gezien een wijdverbreide gebruik voor het waarnemen van technologieën; immunochemische detectie methoden, zoals ELISA&#39;s en MEIAs, zijn tegenwoordig een van de meest gebruikte platforms en toegepast in veel laboratoria 7. Hoewel deze benaderingen uitzonderlijke gevoeligheid en specificiteit, een primaire doelstelling van vele onderzoeksgroepen te bereiken in de afgelopen jaren is het verbeteren en optimalise...

Reagentia <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Kaliumchloride </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumdiwaterstoffosfaat </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dinatriumwaterstoffosfaat </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 watervrij </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hydroxymethyl]-aminomethaan </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (bovine serum albumine) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftyl fosfaat dinatriumzout </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Magere melk blokkeren oplossing - niet-vette droge melk </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine), voorraad-oplossing (1 mg / ml in PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> De HT-2-KLH conjugaat werd verkregen door de CDI-methode waarbij de vrije OH-groepen op positie 3 en 4 bij de HT-2-toxine werden geactiveerd door N, N&#39;-carbonyldiimidazool (CDI) en de geactiveerde HT-2-toxine werd laat om te reageren met aminogroups van het eiwit (KLH) om een ​​stabiele carbammate koppeling te genereren. </td></tr><tr><td> Secundaire gelabelde antilichaam: Anti-muis IgG (H + L), van paarden, geconjugeerd met alkalische fosfatase, concentratie 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2-toxine </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnetische korrels: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Concentratie 2 x 10 9 kralen / ml. </td></tr></table> Oplossingen <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Naam van het serum </td><td> Voorbereiding </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 </td><td> Los 0,20 g kaliumchloride, 0,20 g kaliumdiwaterstoffosfaat, 1,16 g dinatriumwaterstoffosfaat en 8,00 g natriumchloride in 900 ml water </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine buffer, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8 </td><td> Los 0.0476g van MgCl 2 watervrije en 7.3.59 g KCl in ~ 300 ml water. Voeg na oplossing 51 ml van de DEA (99,5%). Pas de pH op 9,8 met HCl (6 M). Verdun tot 500 ml met water. </td><td></td></tr><tr><td> Boraat buffer, 0,1 M, pH 9,5 </td><td> Los 3,09 g van H 3 BO 3 in ~ 300 ml gedestilleerd water, de pH instellen op 9,5 met NaOH en / of HCl (6 M of lagere concentraties). Verdun tot 500 ml met gedestilleerd water. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Los 3,85 g Tris [hydroxymethyl]-aminomethaan in 100 ml water. Aan te passen aan de pH 8.5 met NaOH en / of HCl (6 M of lagere concentraties). Verdun tot 200 ml met water. </td><td></td></tr><tr><td> Tris-buffer + BSA-oplossing (0,1%), pH 8,4 </td><td> Los 0,050 g van de BSA in 50 ml van de TRIS-buffer pH 8,4. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> PBS-buffer + Tween ® 0,05% </td><td> Los 0,250 g Tween 20 in 500 ml van de vooraf bereide PBS-buffer, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS-buffer + BSA-oplossing 0,1% </td><td> Los 0,050 g van de BSA in 50 ml PBS-buffer, pH 7,3. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> PBS-buffer + BSA 0,1% + 0,02% NaN 3 </td><td> Los 0,050 g van de BSA en 0.010 van NaN 3 in 50 ml PBS-buffer, pH 7,3. </td><td> Opslag solution </td></tr><tr><td> Enzymatische substraat </td><td> Los 0,010 g 1-naftyl fosfaat natriumzout in 100 ml van de DEA buffer pH 9,8. Strak Wikkel de kolf in aluminiumfolie. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> Magere melk blockingbuffer </td><td> Voeg 0,20 g Blotting Grade Blocker niet-vette droge melk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) tot 200 ml PBS buffer pH 7,3. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> HT-2-stockoplossing </td><td> Los 10 mg trichothecenen HT-2-toxine flacon, in 10 ml acetonitril te geven een oplossing met een concentratie van 1 mg / ml. </td><td> Opgesplitst deze oplossing in voor eenmalig gebruik aliquots van 30 ml en sla ze op minder dan -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 standaard-werkoplossing </td><td> Pipetteer 20 ml van de HT-2-toxine voorraad oplossing in een 2 ml geijkte maatkolf en verdun met acetonitril om een ​​HT-2-werkende oplossing met 10 ug / ml van trichothecenen toxine te verkrijgen. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> HT-2 Werken kalibrant oplossingen </td><td> Verdun de HT-2 standaard-werkoplossing (10 ug / ml) aan het werken kalibratieoplossing 100 ng / ml te bereiden. Verdunnen HT-2 werkdagen kalibratieoplossing 100 ng / ml te bereiden op het werken kalibratieoplossing oplossingen van de volgende concentraties 0 (leeg), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Deze oplossingen moeten vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> HT-2-geconjugeerd met KLH </td><td> Opgesplitst HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) stockoplossing (1 mg / ml in PBS) in voor eenmalig gebruik porties van 350 ui. </td><td> Bewaar aliquots bij -30 ° C. </td></tr><tr><td> Specifiek monoklonaal antilichaam </td><td> 1:350 verdunnen (v: v) de voorraad concentratie (1,383 mg / ml) van het monoklonale antilichaam in PBS om te gebruiken in de concurrentie stap </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op het moment van gebruik. 10 ml antilichaam voorraad oplossing in PBS voor een uiteindelijk volume van 3,5 ml, genoeg zijn om 17 normen en / of monsters te analyseren. </td></tr><tr><td> Secundaire gelabelde antilichaam </td><td> Anti-muis IgG (H + L) geconjugeerd met alkalische fosfatase is verdund 1:100 (v: v) in PBS om te gebruiken in de concurrentie stap. </td><td> 100 pi antilichaam voorraad oplossing in PBS voor een uiteindelijk volume van 10 ml, is voldoende om 25 normen en / of monsters te analyseren. Deze oplossing moet vers worden bereid op het moment van gebruik. </td></tr></table> Apparaat <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Magnetic Particle Concentrator: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens instrument </td><td> PalmSens </td><td> Voorzien van PalmSens Lite, Serial kabel tussen PC en laptop Mux opties software </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Acht kanaals Mux elektrisch contact </td><td> met de hand gemaakt </td><td></td></tr><tr><td> Strip met acht gezeefdrukt elektroden (SPE&#39;s) </td><td> met de hand gemaakt </td><td></td></tr><tr><td> Speciaal ontworpen voor de ondersteuning van elektroden strip </td><td> met de hand gemaakt </td><td> Inclusief 8 neodymium magneten die elk bevindt zich onder elke werkdag elektrode-oppervlak van de SPE </td></tr><tr><td> Gekalibreerde microliter pipetten </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Magnetische roerder en roer bars. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glazen bekers (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Maatkolven (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 en 2 ml Eppendorf buizen. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Falcon ™ tubes van 5 ml en 15 ml. </td><td> Valk </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorium Vortex Mixer </td><td></td><td> Gebruik geen vortexmixer aan magnetische bolletjes gecoat met HT2-KLH of gekoppelde mengen met een immunologische ketting om te voorkomen dat denaturering van proteic onderdelen </td></tr><tr><td> Laboratorium oven of thermostaat ruimte </td><td></td><td> Kies een oven in staat om een ​​temperatuur van 37 ± 3 ° C te houden </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunoassays zijn een goed alternatief voor de duurdere en tijdrovende kwantitatieve HPLC of GC 1, 2 methoden voor het screenen detectie van gevaarlijke mycotoxinen in levensmiddelen. In dit protocol laten we zien hoe te fabriceren en te ondervragen een elektrochemische competitieve enzyme linked immunomagnetische assay gebaseerd op het gebruik van magnetische beads als vaste ondersteuning voor de immunochemische keten 3 en gezeefdrukt elektroden sensing platform. Onze methode heeft tot doel vast te stellen het totale bedrag van de HT-2 en T-2-toxine, mycotoxinen die behoren tot de trichothecenen familie en van groot belang voor de gezondheid van de mens 4. Het gebruik van een antilichaam kloon met een kruis reactiviteit van 100% naar HT-2 en T-2 maakt het mogelijk om gelijktijdig zowel de toxines te detecteren met een vergelijkbare gevoeligheid 5. De eerste stap van onze test is de coating stap waar we HT2-KLH conjugaat toxine immobiliseren op het oppervlak van de magnetische kralen. Na een blokkerende stap die nodig is om niet-specifieke absorptie te voorkomen, de toevoeging van een monoklonaal antilichaam kan de concurrentie tussen de geïmmobiliseerde HT-2 en gratis HT-2 of T-2 aanwezig is in het monster of opgelost in een standaard oplossing. Aan het einde van de wedstrijd stap, het bedrag van monoklonale antilichaam gekoppeld aan het geïmmobiliseerde HT-2 zullen worden omgekeerd evenredig aan de hoeveelheid gif in de monsteroplossing. Een secundaire antilichaam gelabeld met alkalische fosfatase (AP) wordt gebruikt om de binding tussen de specifieke antilichaam en het geïmmobiliseerde HT-2 te onthullen. De laatste meting stap wordt uitgevoerd door het droppen van een hoeveelheid van magnetische kraal ophanging, wat overeenkomt met een specifiek monster / standaard oplossing, op het oppervlak van een gezeefdrukte werkende elektrode, magnetische korrels worden geïmmobiliseerd en geconcentreerd door middel van een magneet precies onder de gezeefdrukt elektrode. Na twee minuten incubatie tussen magnetische kralen en een substraat voor AP, is de enzymatische product gedetecteerd door Differential Pulse voltammetrie (DPV) met behulp van een draagbaar instrument (PalmSens) ook in staat om automatisch acht metingen te starten binnen een interval van enkele seconden.

Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

Detectie van eiwit ubiquitinering

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Homogene snelle detectie van biologische testen met behulp van Magnetic Modulation biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Directe detectie van de acetaat-vormende activiteit van het enzym acetaat Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Bioassay als een screeningsinstrument voor Host Plant Vluchtige stoffen

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...