Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
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Autoren möchten Nancy Downer und alle Mitglieder aus dem Labor für Analytische Chemie an der Universität Rom &quot;Tor Vergata&quot; Danke für ihre Mitarbeit und logistische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das EU-Projekt &quot;Biocop&quot; unterstützt.

1) Blocking beschichteten magnetischen Kügelchen: Gehen Sie wie folgt zu beschichteten magnetischen Kügelchen Block: <ol><li> Einen Satz von 2 ml Eppendorf-Röhrchen; </li><li> Homogenisieren (Schütteln, aber nicht Vortexen) beschichteten magnetischen Kügelchen (siehe Anhang für die Herstellung von beschichteten magnetischen Kügelchen) mit der Probe rotierenden Mischer; </li><li> Unmittelbar nach der Homogenisierung, Pipette 10 ul der beschichteten magnetischen Kügelchen in jedem einze...

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

Die Verwendung von Antikörpern als biomolekularen Erkennung Sonde hat eine breite Anwendung zur Erfassung von Technologien gesehen; immunchemischen Nachweis Methoden, wie z. B. ELISAs und MEIAs sind heutzutage unter den am häufigsten verwendeten und angewandte Plattformen in vielen Labors 7. Während diese Ansätze zu erzielen außergewöhnliche Sensitivität und Spezifität, ein primäres Ziel vieler Forschergruppen in den letzten Jahren hat sich der Verbesserung und Optimierun...

Reagenzien <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumdihydrogenphosphat </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dinatriumhydrogenphosphat </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 wasserfrei </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hydroxymethyl]-aminomethan </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Rinderserum-Albumin) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-Naphthyl-Phosphat Dinatriumsalz </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Magermilch blockiert Lösung - nicht Magermilchpulver </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 konjugiert mit KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin), Stammlösung (1 mg / ml in PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> Die HT-2-KLH-Konjugat wurde durch CDI-Methode, bei der die freie OH-Gruppen auf Position 3 und 4 an der HT-2 Toxin, das von N, N&#39;-Carbonyldiimidazol (CDI) und der aktivierten HT-2 Toxin wurde aktiviert wurden erhalten lassen sich mit Aminogruppen des Proteins (KLH) reagieren, um eine stabile carbammate Verknüpfung erzeugen. </td></tr><tr><td> Sekundäre markierte Antikörper: Anti-Maus IgG (H + L) vom Pferd, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, Konzentration 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2-Toxin </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnetic Beads: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Konzentration 2 x 10 9 Beads / ml. </td></tr></table> Lösungen <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Vorbereitung </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 </td><td> Dissolve 0,20 g Kaliumchlorid, 0,20 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1,16 g Dinatriumhydrogenphosphat und 8,00 g Natriumchlorid in 900 ml Wasser </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolaminpuffer, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9,8 </td><td> Lösen Sie 0.0476g von MgCl 2 wasserfrei und 7.3.59 g KCl in ~ 300 ml Wasser. Nach der Auflösung add 51 ml DEA (99,5%). Der pH-Wert auf 9,8 mit HCl (6 M). Verdünnen auf 500 ml mit Wasser. </td><td></td></tr><tr><td> Borat-Puffer, 0,1 M, pH 9,5 </td><td> Dissolve 3,09 g H 3 BO 3 in ~ 300 ml destilliertem Wasser, pH-Wert auf 9,5 mit NaOH und / oder HCl (6 M oder niedrigere Konzentrationen). Verdünnen auf 500 ml mit destilliertem Wasser. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS-Puffer, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Dissolve 3,85 g Tris [hydroxymethyl]-aminomethan in 100 ml Wasser. Passen Sie auf pH 8,5 mit NaOH und / oder HCl (6 M oder niedrigere Konzentrationen). Verdünnen auf 200 ml mit Wasser. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS-Puffer + BSA-Lösung (0,1%), pH 8,4 </td><td> Lösen Sie 0,050 g BSA in 50 ml Tris-Puffer pH 8,4. </td><td> Diese Lösung muss frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> PBS-Puffer + Tween ® 0,05% </td><td> Lösen Sie 0,250 g Tween 20 in 500 ml der zuvor hergestellten PBS-Puffer, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS-Puffer + BSA-Lösung 0,1% </td><td> Lösen Sie 0,050 g BSA in 50 ml PBS-Puffer, pH 7,3. </td><td> Diese Lösung muss frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> PBS-Puffer + 0,1% BSA + NaN 3 0,02% </td><td> Lösen Sie 0,050 g BSA und 0,010 von NaN 3 in 50 ml PBS-Puffer, pH 7,3. </td><td> Storage-Solution </td></tr><tr><td> Enzymatische Substrat </td><td> Lösen Sie 0,010 g 1-Naphthyl-Phosphat-Natriumsalz in 100 ml DEA-Puffer pH 9,8. Der Kolben wird fest in Alufolie. </td><td> Diese Lösung muss frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> Magermilch Blockierungslösung </td><td> Add 0,20 g Blotting Grade Blocker fettfreie trockene Milch (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) zu 200 ml PBS-Puffer pH 7,3. </td><td> Diese Lösung muss frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> HT-2-Stammlösung </td><td> Lösen Sie 10 mg Trichothecen HT-2-Toxin Fläschchen, in 10 ml Acetonitril zu geben eine Lösung mit einer Konzentration von 1 mg / ml. </td><td> Split bis diese Lösung in Einweg-Aliquots von 30 ml und speichern sie auf weniger als -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2-Working-Standard-Lösung </td><td> Pipette 20 ml der HT-2-Toxin-Stammlösung in ein 2 ml-Messkolben und verdünnt mit Acetonitril zu einer HT-2 funktionierende Lösung mit 10 ug / ml Trichothecene Toxin zu erhalten. </td><td> Diese Lösung sollte frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> HT-2-Working Kalibrierlösung Lösungen </td><td> Verdünnen Sie die HT-2 arbeitet Standard-Lösung (10 pg / ml) auf die Zusammenarbeit Kalibrierlösung 100 ng / ml herzustellen. Verdünnen HT-2 arbeiten Kalibrierlösung 100 ng / ml auf die Arbeitsunterlagen vorzubereiten Kalibrierlösung Lösungen der folgenden Konzentrationen 0 (leer), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Diese Lösungen müssen bereit sein, am Tag der Verwendung frisch. </td></tr><tr><td> HT-2 konjugiert mit KLH </td><td> Split up HT-2 konjugiert mit KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin) Stammlösung (1 mg / ml in PBS) in Einweg-Aliquots von 350 ul. </td><td> Shop Aliquots bei -30 ° C. </td></tr><tr><td> Spezifischer monoklonaler Antikörper </td><td> Verdünnen 1:350 (v: v) die Aktie Konzentration (1,383 mg / ml) des monoklonalen Antikörpers in PBS, um im Wettbewerb Schritt verwenden </td><td> Diese Lösung muss bereit sein zum Zeitpunkt der Verwendung frischer werden. 10 ml Antikörper-Stammlösung in PBS für ein Endvolumen von 3,5 ml, reichen bis 17 Normen und / oder Proben zu analysieren. </td></tr><tr><td> Sekundärer markierter Antikörper </td><td> Anti-Maus IgG (H + L) konjugiert mit alkalischer Phosphatase wird verdünnt 1:100 (v: v) in PBS, um im Wettbewerb Schritt zu verwenden. </td><td> 100 ul Antikörper-Stammlösung in PBS für ein Endvolumen von 10 ml, reichen bis 25 Normen und / oder Proben zu analysieren. Diese Lösung muss bereit sein zum Zeitpunkt der Verwendung frischer werden. </td></tr></table> Apparat <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Magnetic Particle Concentrator: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens Instrument </td><td> PalmSens </td><td> Ausgestattet mit PalmSens Lite, Serial-Kabel verbindet PC Laptop und Mux Optionen Software </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Acht-Kanal Mux elektrischen Kontakt </td><td> Hand gemacht </td><td></td></tr><tr><td> Streifen mit acht Siebdruck-Elektroden (SPEs) </td><td> Hand gemacht </td><td></td></tr><tr><td> Speziell entwickelt für Elektroden Streifen </td><td> Hand gemacht </td><td> Inklusive 8 Neodym-Magneten von denen jeder unter jedem Arbeitstag Elektrodenfläche der SPE gelegt wird </td></tr><tr><td> Kalibriert Mikroliterpipetten </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Magnetrührer und Rührstäbchen. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bechergläser (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Messkolben (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 und 2 ml Eppendorf-Röhrchen. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Falcon ™ Tuben 5ml und 15ml. </td><td> Falke </td><td></td></tr><tr><td> Laboratory Vortex Mixer </td><td></td><td> Verwenden Sie keine Vortex-Mixer an magnetische Kügelchen mit HT2-KLH beschichtet oder in Verbindung mit immunologischen Kette resuspendieren zu vermeiden Denaturierung von Proteinadsorption Teile </td></tr><tr><td> Laborofen oder thermostatisierten Raum </td><td></td><td> Wählen Sie einen Ofen in der Lage, eine Temperatur von 37 ± 3 ° C zu halten </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunoassays sind eine gültige Alternative zu den teuren und zeitaufwendigen quantitative HPLC-oder GC-1, 2 Methoden für das Screening Erkennung von gefährlichen Mykotoxinen in Nahrungsmitteln. In diesem Protokoll zeigen wir, wie zu fertigen und zu verhören einen elektrochemischen wettbewerbsfähigen enzyme linked immunomagnetische Assay, der auf die Verwendung von magnetischen Kügelchen als feste Unterstützung für den immunchemischen Kette 3 und Siebdruck-Elektroden als sensing-Plattform. Unsere Methode zielt darauf ab, den Gesamtbetrag der HT-2 und T-2-Toxine, Mykotoxine aus der Trichothecene Familie und von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit 4 zu bestimmen. Der Einsatz eines Antikörpers Klon mit einer Kreuzreaktivität von 100% gegenüber HT-2 und T-2 ermöglicht die gleichzeitige Nachweis beider Toxine mit ähnlicher Empfindlichkeit 5. Der erste Schritt unseres Tests ist die Beschichtung Schritt, wo wir immobilisieren HT2-KLH-Konjugat-Toxin auf die Oberfläche des magnetischen Kügelchen. Nach einem Blocking-Schritt notwendig, um unspezifische Absorptionen zu vermeiden, kann die Zugabe eines monoklonalen Antikörpers die Konkurrenz zwischen immobilisierten HT-2-und HT-2-freien oder T-2 in der Probe vorhanden oder gelöst in einem Standard-Lösung. Am Ende des Wettbewerbs Schritt, die Höhe des monoklonalen Antikörpers verknüpft die immobilisierten HT-2 ist umgekehrt proportional zur Menge des Toxins in der Probelösung. Ein sekundärer Antikörper mit alkalischer Phosphatase (AP) bezeichnet wird verwendet, um die Bindung zwischen den spezifischen Antikörper und dem immobilisierten HT-2 offenbaren. Die abschließende Messung Schritt wird durch Fallenlassen eines Aliquots Magnetic-Bead-Suspension durchgeführt, das entspricht einer spezifischen Probe / Standard-Lösung auf der Oberfläche eines Siebdruck-Arbeitselektrode; magnetischen Beads immobilisiert und mit Hilfe eines Magneten genau unter dem platziert konzentriert Siebdruck-Elektrode. Nach zwei Minuten der Inkubation zwischen magnetischen Kügelchen und ein Substrat für AP, ist die enzymatische Produkt durch Differential-Puls-Voltammetrie (DPV) mit einem tragbaren Gerät (PalmSens) auch in der Lage, automatisch acht Messungen in einem Intervall von wenigen Sekunden starten erkannt.

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Ein Protokoll, um Trichothecene (Mykotoxine, die für die menschliche Gesundheit) mit einem neu entwickelten Screening-Methode auf einem wettbewerbsfähigen immunchemischen Verfahren und eine endgültige elektrochemischer Detektion basierte Erkennung demonstriert.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

Detektion von Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Forschung

Biologie

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

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Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

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Direkter Nachweis der Acetat-bildenden Aktivität des Enzyms Acetat-Kinase

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Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

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qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

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Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers

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