Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
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लेखक के लिए विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, रोम के विश्वविद्यालय &quot;टो Vergata&quot; की प्रयोगशाला से उनके सहयोग और संभारतंत्रीय सहायता के लिए नैन्सी downer और सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम यूरोपीय संघ परियोजना &quot;BioCop&quot; द्वारा समर्थित किया गया.

1) लेपित चुंबकीय मोती अवरुद्ध: आगे बढ़ें लेपित चुंबकीय मोतियों को ब्लॉक के रूप में पालन करें: <ol><li> 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों का एक सेट तैयार करना; </li><li> Homogenize (मिलाते हुए नहीं बल्कि vortexing) लेपित चुंबकीय मो...

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	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

biomolecular मान्यता जांच के रूप में एंटीबॉडी का उपयोग संवेदन प्रौद्योगिकियों के लिए एक व्यापक प्रयोग देखा है, जैसे ELISAs और MEIAs immunochemical पता लगाने के तरीके, रहे हैं, आजकल कई प्रयोगशालाओं में 7 सबसे अधिक इस्तेमाल क?...

अभिकर्मकों <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> पोटेशियम क्लोराइड </td><td> सिग्मा </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> पोटेशियम dihydrogen फॉस्फेट </td><td> सिग्मा </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Disodium हाइड्रोजन फॉस्फेट </td><td> सिग्मा </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> सोडियम क्लोराइड </td><td> सिग्मा </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 निर्जल </td><td> सिग्मा </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> डीईए (99.5%) </td><td> सिग्मा </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> 37% एचसीएल </td><td> सिग्मा </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> 3 एच बो 3 </td><td> सिग्मा </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris - aminomethane [hydroxymethyl] </td><td> सिग्मा </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (गोजातीय सीरम albumin) </td><td> सिग्मा </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> सिग्मा </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> 20 के बीच </td><td> सिग्मा </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 3 NaN </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-Naphthyl फॉस्फेट disodium नमक </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> स्किम्ड दूध अवरुद्ध समाधान गैर वसा शुष्क दूध </td><td> जैव - रेड </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 KLH (कीहोल लंगड़ाहट hemocyanin), शेयर समाधान (1 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर) के साथ संयुग्मित: </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> HT-2-KLH संयुग्म CDI - विधि जहां 3 HT-2 विष में और स्थिति 4 पर मुक्त OH समूहों द्वारा एन, N&#39;- carbonyldiimidazole (CDI) और सक्रिय HT-2 विष था सक्रिय थे द्वारा प्राप्त किया गया था प्रोटीन (KLH) के aminogroups के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए एक स्थिर carbammate उठाना उत्पन्न करते हैं. </td></tr><tr><td> माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल: विरोधी माउस घोड़े से आईजीजी (एच एल +), alkaline फॉस्फेट के साथ संयुग्मित, एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल. </td><td> वेक्टर प्रयोगशालाओं </td><td> एपी 2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 विष </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> चुंबकीय मोतियों: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> एम - 280 Tosylactivated </td><td> 2 एकाग्रता x 10 9 माला / एमएल. </td></tr></table> समाधान <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> तैयार </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> फास्फेट (पीबीएस) खारा, 7.4 पीएच buffered </td><td> पानी की 900 मिलीलीटर में 0.20 ग्राम की पोटेशियम क्लोराइड, पोटेशियम dihydrogen फॉस्फेट के 0.20 जी, disodium हाइड्रोजन फॉस्फेट की 1.16 ग्राम और 8.00 ग्राम सोडियम क्लोराइड के भंग </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine बफर, डीईए, 0.97 एम + 1 मिमी 2 MgCl + 0.15 एम KCl, 9.8 पीएच </td><td> MgCl 2 निर्जल और ~ पानी की 300 मिलीलीटर में 7.3.59 KCl के छ 0.0476g भंग. विघटन के बाद डीईए (99.5%) के 51 मिलीलीटर जोड़ें. एचसीएल (6 एम) के साथ 9.8 करने के लिए पीएच को समायोजित करें. 500 मिलीलीटर पानी के साथ पतला. </td><td></td></tr><tr><td> Borate बफर, एम 0.1, 9.5 पीएच </td><td> एच 3 ~ आसुत पानी की 300 मिलीलीटर में 3 बो के 3.09 छ भंग, 9.5 से NaOH और / या एचसीएल (6 एम या कम सांद्रता) के साथ पीएच को समायोजित. 500 मिलीलीटर के लिए आसुत जल के साथ पतला. </td><td></td></tr><tr><td> Tris बफर, एम 0.2, 8.5 पीएच </td><td> Tris पानी की 100 मिलीलीटर में aminomethane [hydroxymethyl] के 3.85 छ भंग. NaOH और / या एचसीएल (6 एम या कम सांद्रता) के साथ 8.5 पीएच को समायोजित करें. 200 मिलीलीटर पानी के साथ पतला. </td><td></td></tr><tr><td> बफर Tris + BSA (0.1%) समाधान, 8.4 पीएच </td><td> Tris बफर पीएच 8.4 का 50 मिलीलीटर में BSA के 0.050 ग्राम भंग. </td><td> यह समाधान हौसले उपयोग के दिन पर तैयार होना चाहिए. </td></tr><tr><td> PBS बफर + के बीच ® 0.05% </td><td> पहले से तैयार PBS बफर, पीएच 7.4 की 500 मिलीलीटर में 20 के बीच के 0.250 ग्राम भंग </td><td></td></tr><tr><td> PBS बफर + BSA समाधान 0.1% </td><td> PBS बफर, 7.3 पीएच के 50 मिलीलीटर में BSA के 0.050 ग्राम भंग. </td><td> यह समाधान हौसले उपयोग के दिन पर तैयार होना चाहिए. </td></tr><tr><td> PBS बफर + 0.1% BSA + NaN 3 0.02% </td><td> BSA के 0.050 ग्राम और 0.010 3 NaN के PBS बफर, 7.3 पीएच के 50 मिलीलीटर में भंग. </td><td> संग्रहण पution </td></tr><tr><td> Enzymatic सब्सट्रेट </td><td> डीईए बफर पीएच 9.8 की 100 मिलीलीटर में 1-Naphthyl फॉस्फेट सोडियम नमक के 0.010 ग्राम भंग. लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी में फ्लास्क कसकर. </td><td> यह समाधान हौसले उपयोग के दिन पर तैयार होना चाहिए. </td></tr><tr><td> स्किम्ड दूध अवरुद्ध समाधान </td><td> PBS बफर पीएच 7.3 की 200 मिलीलीटर के लिए ग्रेड गैर मोटी अवरोधक ड्राई मिल्क (जैव रेड, हरक्यूलिस, सीए, संयुक्त राज्य अमरीका) सोख्ता के 0.20 छ जोड़ें. </td><td> यह समाधान हौसले उपयोग के दिन पर तैयार होना चाहिए. </td></tr><tr><td> HT-2 शेयर समाधान </td><td> Trichothecene HT-2 विष शीशी के 10 मिलीग्राम दे acetonitrile के 10 मिलीलीटर में, भंग 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के साथ एक समाधान है. </td><td> 30 मिलीलीटर की एकल उपयोग aliquots में इस समाधान भाजित और -30 डिग्री सेल्सियस से भी कम समय में उन्हें दुकान </td></tr><tr><td> HT-2 मानक समाधान कार्य </td><td> पिपेट HT-2 विष शेयर समाधान के एक 2 मिलीलीटर में 20 मिलीलीटर बड़ा फ्लास्क calibrated और acetonitrile के साथ पतला करने के लिए HT-2 काम कर रहे 10 / μg trichothecene विष के मिलीलीटर युक्त समाधान प्राप्त है. </td><td> यह समाधान हौसले उपयोग के दिन पर तैयार होना चाहिए. </td></tr><tr><td> HT-2 कार्य calibrant समाधान </td><td> HT-2 काम कर मानक (10 μg / एमएल) समाधान के लिए काम कर calibrant समाधान 100 एनजी / मिली तैयार पतला. पतला HT-2 calibrant समाधान काम 100 एनजी / मिलीलीटर निम्नलिखित 0 (रिक्त) सांद्रता, 0.5, 1, 2, 4, 10 एनजी / मिली calibrant समाधान काम कर तैयार है. </td><td> इन समाधानों के उपयोग के दिन पर ताजा तैयार होना चाहिए. </td></tr><tr><td> HT-2 KLH के साथ संयुग्मित </td><td> HT-2 संयुग्मित 350 μl के एकल उपयोग aliquots में KLH (कीहोल लंगड़ाहट hemocyanin) शेयर (1 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर) समाधान के साथ भाजित. </td><td> -30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots </td></tr><tr><td> विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी </td><td> मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के शेयर (1.383 मिलीग्राम / एमएल) पीबीएस में प्रतियोगिता कदम में उपयोग करने के लिए एकाग्रता: 1:350 (v v) पतला </td><td> यह समाधान उपयोग के क्षण में ताजा तैयार होना चाहिए. 3.5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए 10 मिलीलीटर एंटीबॉडी पीबीएस में शेयर समाधान पर्याप्त हैं 17 मानकों और / या नमूनों का विश्लेषण. </td></tr><tr><td> माध्यमिक लेबल एंटीबॉडी </td><td> पीबीएस में प्रतियोगिता कदम में उपयोग करने के लिए: एंटी माउस (एच एल +) आईजीजी alkaline फॉस्फेट के साथ संयुग्मित 1:100 (ध् ध्) पतला है. </td><td> 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए 100 μl एंटीबॉडी पीबीएस में शेयर समाधान, 25 मानकों और / या नमूनों का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त हैं. यह समाधान उपयोग के क्षण में ताजा तैयार होना चाहिए. </td></tr></table> उपकरण <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> चुंबकीय कण Concentrator: MPC ® - एस </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens साधन </td><td> PalmSens </td><td> PalmSens लाइट, सीरियल केबल को जोड़ने पीसी लैपटॉप और Mux विकल्प सॉफ्टवेयर के साथ प्रदान की </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens बहुसंकेतक </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> आठ चैनल Mux बिजली संपर्क </td><td> हाथ से बना </td><td></td></tr><tr><td> आठ स्क्रीन मुद्रित इलेक्ट्रोड (SPES) के साथ पट्टी </td><td> हाथ से बना </td><td></td></tr><tr><td> इलेक्ट्रोड पट्टी के लिए विशेष रूप से डिजाइन समर्थन </td><td> हाथ से बना </td><td> 8 neodymium मैग्नेट प्रत्येक जिनमें से प्रत्येक कार्य विशेष के इलेक्ट्रोड की सतह के नीचे रखा जाता है शामिल </td></tr><tr><td> कैलिब्रेटेड microliter pipettes </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> चुंबकीय उत्तेजक और हलचल सलाखों. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ग्लास beakers (100, 50, 20 मिलीलीटर). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> बड़ा बोतल (2ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 और 2ml Eppendorf ट्यूबों. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> फाल्कन 5ml और 15ml के ™ ट्यूबों. </td><td> बाज़ </td><td></td></tr><tr><td> प्रयोगशाला भंवर मिक्सर </td><td></td><td> का उपयोग करने के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी श्रृंखला के साथ चुंबकीय मोतियों HT2 - KLH के साथ लेपित है या लिंक की गई resuspend नहीं भंवर मिक्सर proteic भागों के denaturing से बचने </td></tr><tr><td> प्रयोगशाला ओवन या thermostated कमरा </td><td></td><td> 37 के 3 ± डिग्री सेल्सियस तापमान रखने के लिए एक सक्षम ओवन चुनें </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunoassays अधिक महंगा है और समय लेने मात्रात्मक HPLC या 1 जीसी, खाद्य वस्तुओं में खतरनाक mycotoxins की स्क्रीनिंग का पता लगाने के लिए 2 तरीकों के लिए एक वैध विकल्प हैं. इस प्रोटोकॉल में हम बताते हैं कैसे बनाना और एक विद्युत प्रतिस्पर्धी एनजाइम पूछताछ लिंक्ड immunomagnetic immunochemical मंच संवेदन के रूप में 3 और श्रृंखला स्क्रीन मुद्रित इलेक्ट्रोड के लिए ठोस समर्थन के रूप में चुंबकीय मोतियों के उपयोग पर आधारित परख. हमारे विधि HT-2 और टी 2 विषाक्त पदार्थों की कुल राशि, trichothecenes और मानव स्वास्थ्य के लिए 4 महान चिंता के परिवार के लिए संबंधित mycotoxins निर्धारित करना है. HT-2 और T-2 की दिशा में 100% की एक क्रॉस जेट के साथ एक एंटीबॉडी क्लोन के उपयोग के साथ ही साथ इसी तरह की संवेदनशीलता 5 दोनों विषाक्त पदार्थों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. हमारे परख का पहला कदम कोटिंग कदम है जहाँ हम चुंबकीय मोतियों की सतह पर HT2 KLH संयुग्म विष स्थिर है. एक अवरुद्ध कदम है, गैर विशिष्ट absorptions से बचने के लिए आवश्यक के बाद, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के अलावा की अनुमति देता है immobilized HT-2 और मुक्त नमूना HT-2 या T-2 वर्तमान में या एक मानक समाधान में भंग के बीच प्रतिस्पर्धा है. प्रतियोगिता कदम के अंत में, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की राशि से जुड़े immobilized HT-2 inversely नमूना समाधान में विष की राशि के लिए आनुपातिक हो जाएगा. एक माध्यमिक alkaline फॉस्फेट (एपी) के साथ लेबल एंटीबॉडी विशिष्ट एंटीबॉडी और immobilized HT-2 के बीच बंधन प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अंतिम माप कदम चुंबकीय मनका निलंबन की एक विभाज्य छोड़ने के द्वारा किया जाता है, एक विशिष्ट नमूना / मानक समाधान करने के लिए इसी, एक स्क्रीन मुद्रित काम कर इलेक्ट्रोड की सतह पर, चुंबकीय मोतियों immobilized और के तहत ठीक रखा चुंबक के माध्यम से ध्यान केंद्रित कर रहे हैं स्क्रीन मुद्रित इलेक्ट्रोड. चुंबकीय मोतियों और एपी के लिए एक सब्सट्रेट के बीच दो मिनट ऊष्मायन के बाद, enzymatic उत्पाद विभेदक पल्स (DPV) Voltammetry एक पोर्टेबल (PalmSens) साधन भी कुछ सेकंड के अंतराल के भीतर आठ स्वतः माप आरंभ करने में सक्षम का उपयोग कर के द्वारा पता लगाया है.

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Trichothecenes मानव स्वास्थ्य के लिए चिंता का विषय (mycotoxins) एक नव विकसित स्क्रीनिंग एक प्रतियोगी immunochemical विधि और एक अंतिम विद्युत का पता लगाने के आधार पर विधि का उपयोग का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन है.

ELIME Mycotoxin जांच के लिए विधि (एनजाइम इम्यूनो चुंबकीय विद्युत लिंक्ड)

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

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