Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
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저자들은 협력과 물류 지원 분석 화학, 로마 대학 &quot;토르 Vergata 호텔&quot;의 실험실에서 낸시 다우너 모든 회원에게 감사를 표합니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) 프로젝트 &quot;BioCop&quot;에 의해 지원되었다.

1) 코팅 자성 비즈를 차단 : 로 코팅 자기 구슬을 차단 따라 진행 : <ol><li> 2 ML Eppendorf 튜브 세트를 준비; </li><li> ; (vortexing하지 떨고 있지만) 믹서 회전 샘플을 사용하여 코팅 자기 구슬을 (코팅 자성 비즈의 준비에 대한 부록 참조) 균질 </li><li> 즉시 균질 후 피펫 각각 별도의 Eppendorf 튜브에 코팅 자기 구슬 10 μl; </li><li> 설정의 각 Eppendorf 튜브에 솔루션을 차단 무지방 우유의 1ml?...

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

biomolecular 인식 프로브로 항체의 사용은 감지 기술을 널리 사용 가능성을 보여줬습니다, 같은 ELISAs 및 MEIAs 같은 immunochemical 검색 방법론은 많은 실험실 7 가장 많이 사용되는 응용 플랫폼 간의 요즘입니다. 이러한 방식은 지난 몇 년 동안 뛰어난 감도와 특이성, 많은 연구 그룹의 주요 목표를 달성하는 동시에 공연의 개선과 최적화를하고 있습니다. <p class="jove_conten...

시약 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 시그마 </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 칼륨 dihydrogen 인산 </td><td> 시그마 </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 수소 나트륨 </td><td> 시그마 </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 무수 </td><td> 시그마 </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99.5 %) </td><td> 시그마 </td><td> 31,589 </td><td></td></tr><tr><td> HCL 37% </td><td> 시그마 </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 시그마 </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 [히드록시 메틸] - aminomethane </td><td> 시그마 </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (소 혈청 알부민) </td><td> 시그마 </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 시그마 </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> 트윈 20 </td><td> 시그마 </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 난 3 </td><td> 알드리치 </td><td> 71,290 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - 인산 나트륨 소금 Naphthyl </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> 무지방 우유 차단 솔루션 - 비 지방 건조 우유 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> KLH (키홀의 림펫 Hemocyanin), 주식 솔루션 (PBS 1 MG / ML)와 HT - 2 복합 : </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> HT - 2 - KLH 공액은 HT - 2 독소에 위치 3과 4에서 무료로 OH - 그룹이 N, N&#39; - carbonyldiimidazole (CDI)과 활성 HT - 2 독소 였어요 활성화되었습니다 CDI - 방법으로 얻은 것입니다 안정 carbammate 연계를 생성하는 단백질 (KLH)의 aminogroups와 반응을 보자. </td></tr><tr><td> 보조 라벨 항체 : 말에서 방지 마우스 IgG (H + L), 알카라인 인산 가수 분해 효소와 복합, 집중력 1 MG / ML. </td><td> 벡터 연구소 </td><td> AP - 2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT - 2 독소 </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 자기 구슬 : Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M - 280 Tosylactivated </td><td> 농도 2 X 10 9 구슬 / ML. </td></tr></table> 솔루션 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 준비 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 인산은 생리 (PBS), pH를 7.4 버퍼 </td><td> 물 900 ML에 염화칼륨 0.20 g, 칼륨 dihydrogen 인산의 0.20 g, 나트륨 수소 나트륨 1.16 g의 나트륨 염화물의 8.00 g을 풀다 </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine 버퍼, DEA, 0.97 M + 1 ㎜ MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH를 9.8 </td><td> MgCl 2 무수 물 ~ 300 ML에서 KCl의 7.3.59 g의 0.0476g을 디졸브. 해산 후 DEA 51 ML (99.5 %)를 추가합니다. HCL (6 M)과 9.8으로 산도를 조정합니다. 물 500 ML로 희석. </td><td></td></tr><tr><td> Borate 버퍼, 0.1 M, pH를 9.5 </td><td> 증류수의 ~ 300 ML에 H 3 BO 3 3.09 g을 디졸브, NaOH 및 / 또는 HCL (6 M 이하 농도)를 9.5으로 산도를 조정합니다. 증류수 500 ML로 희석. </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 버퍼, 0.2 M, pH를 8.5 </td><td> 트리스 [히드록시 메틸] 물 100 ML 인 aminomethane의 3.85 g을 디졸브. NaOH 및 / 또는 HCL (6 M 이하 농도)로 산도 8.5을 조절할 수 있습니다. 물 200 ML로 희석. </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 버퍼 + BSA 용액 (0.1 %), 산도 8.4 </td><td> 트리스 버퍼 산도 8.4의 50 ML에 BSA의 0.050 g을 디졸브. </td><td> 이 솔루션은 갓 이용 당일 준비하셔야합니다. </td></tr><tr><td> PBS 버퍼 + 트윈 ® 0.05 % </td><td> 이전에 준비 PBS 버퍼, pH를 7.4 500 ML에 트윈 20 0.250 g을 풀다 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 버퍼 + BSA 용액 0.1 % </td><td> PBS 버퍼, 산도 7.3의 50 ML에 BSA의 0.050 g을 디졸브. </td><td> 이 솔루션은 갓 이용 당일 준비하셔야합니다. </td></tr><tr><td> PBS 버퍼 + BSA 0.1 % + 난 3 0.02 % </td><td> PBS 버퍼, 산도 7.3의 50 ML에 0.050 BSA의 g와 할머니 3 0.010을 디졸브. </td><td> 스토리지 솔ution </td></tr><tr><td> 효소 기판 </td><td> DEA 버퍼 산도 9.8의 100 ML 1 - Naphthyl 인산 나트륨 소금 0.010 g을 디졸브. 알루미늄 호일에 단단히 휴대용 술병을 넣어. </td><td> 이 솔루션은 갓 이용 당일 준비하셔야합니다. </td></tr><tr><td> 무지방 우유 차단 솔루션 </td><td> PBS 버퍼 산도 7.3 200 ML에 학년 차단기 비 팻 건조 우유 (바이오 - 래드, 헤라클레스, CA, 미국)를 모래 바닥의 0.20 g을 추가합니다. </td><td> 이 솔루션은 갓 이용 당일 준비하셔야합니다. </td></tr><tr><td> HT - 2 주식 솔루션 </td><td> 줄 acetonitrile 10 ML에 trichothecene HT - 2 독소의 약병 10 MG를 디졸브 1 MG / ML의 농도와 솔루션입니다. </td><td> 30 ML의 단일 사용 aliquots에이 솔루션을 나눠 -30 ° C. 이하에서 그들을 저장 </td></tr><tr><td> HT - 2 표준 용액 근무 </td><td> 2 ML로 HT - 2 독소 주식 솔루션의 피펫 20 ML은 용적 플라스크를 보정 및 10 μg / trichothecene 독소 ML을 포함 HT - 2 작업 솔루션을 얻기 위해 acetonitrile로 희석. </td><td> 이 솔루션은 갓 이용 당일 준비되어야합니다. </td></tr><tr><td> HT - 2 작업 calibrant 솔루션 </td><td> 작업 calibrant 솔루션 100 NG / ML을 준비하는 HT - 2 작업 표준 용액 (10 μg / ML) 희석. 희석 HT - 2 calibrant 솔루션을 작업 100 NG / 다음과 같은 농도 0 (빈), 0.5, 1, 2, 4, 10 NG / ML의 calibrant 솔루션을 작업 준비 ML. </td><td> 이 솔루션은 사용 당일 신선한 준비되어야합니다. </td></tr><tr><td> KLH와 HT - 2 복합 </td><td> 350 μl의 단일 사용 aliquots로 KLH (키홀의 림펫 Hemocyanin) 주식 솔루션 (PBS 1 MG / ML)와 HT - 2 복합 헤어졌다. </td><td> -30 ° C.에 저장 aliquots </td></tr><tr><td> 특정 단클론 항체 </td><td> 경쟁 단계에서 사용하는 PBS의 단클론 항체의 주식 농도 (1.383 MG / ML) : 1:350 (V V)를 희석 </td><td> 이 솔루션은 사용의 순간에 신선한 준비하셔야합니다. 3.5 ML의 최종 볼륨 PBS에서 10 ML 항체 주식 솔루션은 17 표준 및 / 또는 샘플을 분석하는 데 충분합니다. </td></tr><tr><td> 보조 라벨 항체 </td><td> PBS 경쟁 단계에서 사용하는 : 알카라인 인산 가수 분해 효소와 함께 복합 방지 마우스 IgG (H + L)은 1:100 (V V)를 희석합니다. </td><td> 10 ML의 최종 볼륨 PBS 100 μl 항체 주식 솔루션은 25 표준 및 / 또는 샘플을 분석하는 데 충분합니다. 이 솔루션은 사용의 순간에 신선한 준비하셔야합니다. </td></tr></table> 기구 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 자기 입자 농축기 : MPC ® - S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens 악기 </td><td> PalmSens </td><td> PalmSens 라이트, 직렬 케이블 연결 PC 노트북 및 MUX 옵션 소프트웨어와 함께 제공된 </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens 멀티플렉서 </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> 에이트 채널 MUX 전기 문의 </td><td> 손으로 만든 </td><td></td></tr><tr><td> 여덟 화면 인쇄 전극 (SPEs)와 스트립 </td><td> 손으로 만든 </td><td></td></tr><tr><td> 전극 스트립을 위해 특별히 고안된 지원 </td><td> 손으로 만든 </td><td> SPE의 각 작업 전극 표면 아래에 배치됩니다 각 8 네오디뮴 자석을 포함 </td></tr><tr><td> 보정 microliter의 pipettes </td><td> 길슨 </td><td></td></tr><tr><td> 자기 활동가 및 저어 바. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유리 비커 (100, 50, 20 ML). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 용적 flasks (2ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 및 2ml Eppendorf 튜브. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> 5ml와 15ml의 팰컨 ™ 튜브. </td><td> 매 </td><td></td></tr><tr><td> 연구실 소용돌이 믹서 </td><td></td><td> proteic 부품 denaturing 피하기 위해 면역 체인 HT2 - KLH로 코팅 또는 연결된 자기 구슬을 resuspend에 와동 믹서를 사용하지 마십시오 </td></tr><tr><td> 실험실 오븐이나 thermostated 방 </td><td></td><td> 37 온도 ± 3 ° C.를 유지할 수 오븐을 선택하십시오 </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunoassays은 더 비싼과 시간이 소요되는 정량 HPLC 또는 GC 1, 식품 상품에 유해 mycotoxins의 심사 검출을위한 2 가지 방법에 대한 유효한 대안입니다. 이 프로토콜에서는 플랫폼을 감지으로 immunochemical 체인 3 화면 인쇄 전극에 대한 견고한 지원과 같은 자성 구슬의 사용에 따라 연결 immunomagnetic 분석을 조작하고 전기 경쟁력있는 효소를 심문하는 방법을 보여줍니다. 우리의 방법은 HT - 2 T - 2 독소의 총 금액 trichothecenes 가족과 인간의 건강 4 큰 우려에 속하는 먹은 사람은 미세 독소를 섭취하게 결정하는 것을 목표로하고있다. HT - 2 및 T - 2 향한 100 % 교차 반응과 항체 클론의 사용은 동시에 유사한 민감도 5 독소를 모두 검색할 수 있습니다. 우리의 분석의 첫 번째 단계는 우리가 자기 구슬의 표면에 HT2 - KLH 공액 독소를 무력화 코팅 단계입니다. 불특정 absorptions을 피하기 위해 필요한 차단 단계 후, 단클론 항체의 추가는 허용 고정화 HT - 2와 샘플 무료 HT - 2 T - 2 현재 또는 표준 용액에 녹아있는 사이의 경쟁. 경쟁 단계의 끝에, 단클론 항체의 양을는 링크된 HT - 2 샘플 솔루션에 독소의 금액에 반비례한다 고정화. 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP)로 표시 이차 항체는 특정 항체와 고정화 HT - 2 사이의 바인딩을 공개하는 데 사용됩니다. 최종 측정 단계는 화면 인쇄 작업 전극의 표면에 특정 샘플 / 표준 용액에 해당하는, 자기 비드 정지 나누어지는 놓아 수행, 자석 구슬은 아래에 정확하게 위치 자석에 의해 고정하고 집중되고있다 화면 인쇄 전극. 자기 구슬과 AP의 기판 사이에 부화 두 분 후에 효소 제품은 몇 초 간격 이내에 자동으로 팔 측정을 시작하는 것도 가능 휴대용 악기 (PalmSens)를 사용하여 차동 펄스 Voltammetry (DPV)에 의해 감지됩니다.

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

경쟁력있는 immunochemical 방법과 최종 전기 감지 기능을 기반으로 새로 개발된 검사 방법을 사용하여 trichothecenes을 (인간의 건강에 대한 우려의 mycotoxins) 감지하는 프로토콜이 증명됩니다.

진균 독소의 검출을위한 ELIME (효소가 단백질 자기 전기를 연결) 방법

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

연구

생물학

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

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불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

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효소 아세테이트 키나제의 아세테이트 - 형성 활동의 직접적인 탐지

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