Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
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Los autores desean agradecer a Nancy Downer y todos los miembros del laboratorio de Química Analítica de la Universidad de Roma &quot;Tor Vergata&quot; por su colaboración y apoyo logístico. Este trabajo fue apoyado por el proyecto de la UE &quot;BioCop&quot;.

1) El bloqueo de perlas magnéticas recubiertas con: Proceder de la siguiente manera para bloquear perlas magnéticas recubiertas con: <ol><li> Preparar un conjunto de 2 ml tubos Eppendorf; </li><li> Homogeneizar (temblores, pero no agitación) de perlas magnéticas recubiertas (véase el apéndice para la preparación de perlas magnéticas recubiertas) con la muestra de rotación del mezclador; </li><li> Inmediatamente después de la homogeneización, pipeta de 10 l de perlas magnéticas rec...

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	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

El uso de anticuerpos como la sonda de reconocimiento biomolecular ha visto un uso generalizado de tecnologías de detección, métodos inmunoquímicos de detección, tales como ELISA y Meias, son, hoy en día, entre las plataformas más utilizadas y aplicadas en muchos laboratorios de 7. Si bien estos enfoques lograr una sensibilidad y especificidad, el objetivo principal de muchos grupos de investigación en los últimos años ha sido la mejora y optimización de sus actuaciones...

Reactivos <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Cloruro de potasio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Dihidrógeno fosfato de potasio </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato disódico de hidrógeno </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 anhidro </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil]-aminometano </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albúmina de suero bovino) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftil fosfato disódico sal </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de leche desnatada bloquear - leche en polvo no grasa </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 conjugado con KLH (hemocianina de lapa californiana), solución de reserva (1 mg / ml en PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> El conjugado HT-2-KLH se obtuvo por el CDI-método en el que la libre circulación de grupos OH en la posición 3 y 4 de la toxina HT-2 fueron activados por N, N&#39;-carbonildiimidazol (CDI) y la activa HT-2 toxina vamos a reaccionar con aminogroups de la proteína (KLH) para generar un vínculo carbammate estable. </td></tr><tr><td> Anticuerpo secundario marcado: Anti-ratón IgG (H + L) de caballo, conjugado con fosfatasa alcalina, la concentración de 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 toxina </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Partículas magnéticas: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Concentración de 2 x 10 9 bolas / ml. </td></tr></table> Soluciones <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Preparación </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4 </td><td> Disolver 0,20 g de cloruro de potasio, 0,20 g de dihidrógeno fosfato de potasio, 1,16 g de fosfato disódico de hidrógeno y 8,00 g de cloruro de sodio en 900 ml de agua </td><td></td></tr><tr><td> Dietanolamina de amortiguamiento, la DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8 </td><td> Disolver 0.0476g de MgCl2 anhidro y 7.3.59 g de KCl en ~ 300 ml de agua. Vez disueltos, añadir 51 ml de la DEA (99,5%). Ajustar el pH a 9.8 con HCl (6 M). Diluir hasta 500 ml con agua. </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de borato, 0,1 M, pH 9,5 </td><td> Disolver 3,09 g de H 3 BO 3 en ~ 300 ml de agua destilada, ajustar el pH a 9.5 con NaOH y / o HCl (6 M o menor concentración). Diluir hasta 500 ml con agua destilada. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Disolver 3,85 g de Tris [hidroximetil]-aminometano en 100 ml de agua. Ajustar el pH a 8.5 con NaOH y / o HCl (6 M o menor concentración). Diluir a 200 ml con agua. </td><td></td></tr><tr><td> Tampón TRIS + BSA solución (0,1%), pH 8,4 </td><td> Disolver 0,050 g de BSA en 50 ml de TRIS buffer de pH 8,4. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> Tampón PBS + Tween ® 0,05% </td><td> Disolver 0,250 g de Tween 20 en 500 ml del preparado previamente buffer PBS, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón PBS + BSA solución al 0,1% </td><td> Disolver 0,050 g de BSA en 50 ml de PBS, pH 7,3. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> Tampón PBS + BSA 0,1% + 0,02% NaN3 </td><td> Disolver 0,050 g de BSA y 0.010 de NaN 3 en 50 ml de tampón PBS, pH 7,3. </td><td> Almacenamiento de sollución </td></tr><tr><td> Sustrato enzimático </td><td> Disolver 0,010 g de sal 1-naftil fosfato de sodio en 100 ml de buffer de pH 9,8 DEA. Envolver el matraz herméticamente en papel de aluminio. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> Solución de leche desnatada bloqueo </td><td> Añadir 0,20 g de secante bloqueador de grado de leche sin grasa seca (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) a 200 ml de tampón PBS pH 7,3. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 de la solución madre </td><td> Disolver 10 mg de tricotecenos vial de toxina HT-2, en 10 ml de acetonitrilo para dar una solución con una concentración de 1 mg / ml. </td><td> Dividir esta solución en un solo uso alícuotas de 30 ml y guárdelos a menos de -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 la solución de trabajo estándar </td><td> Colocar 20 ml de HT-2 toxina solución de reserva en una de 2 ml calibrada matraz aforado y diluir con acetonitrilo para obtener una solución HT-2 de trabajo que contiene 10 mg / ml de toxina tricotecenos. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 Trabajo soluciones calibrante </td><td> Diluir el HT-2 solución patrón de trabajo (10 mg / ml) para preparar una solución de trabajo calibrante 100 ng / ml. Diluir HT-2 Solución de trabajo de calibrante 100 ng / ml para preparar soluciones de trabajo calibrador de las siguientes concentraciones 0 (blanco), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Estas soluciones deben estar recién en el día de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 conjugado con KLH </td><td> Dividir HT-2 conjugado con KLH solución stock (hemocianina de lapa californiana) (1 mg / ml en PBS) en un solo uso alícuotas de 350 microlitros. </td><td> Alícuotas de almacenar a -30 ° C. </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal específico </td><td> Diluir 1:350 (v: v) la concentración de acciones (1,383 mg / ml) del anticuerpo monoclonal en PBS para el uso en el paso la competencia </td><td> Esta solución debe prepararse en el momento de su uso. 10 ml de solución de anticuerpos en PBS para obtener un volumen de 3,5 ml, son suficientes para analizar las 17 normas y / o muestras. </td></tr><tr><td> Secundaria de anticuerpos etiquetados </td><td> Anti-ratón IgG (H + L) conjugado con fosfatasa alcalina se diluye 1:100 (v: v) en PBS a utilizar en el paso de la competencia. </td><td> Una solución de 100 l de valores de anticuerpos en PBS para obtener un volumen final de 10 ml, son suficientes para analizar las normas 25 y / o muestras. Esta solución debe prepararse en el momento de su uso. </td></tr></table> Aparato <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Concentrador de partículas magnéticas: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens instrumento </td><td> PalmSens </td><td> Siempre con PalmSens Lite, el cable de serie de conexión PC portátil y el software de las opciones de Mux </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens multiplexor </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Ocho canales de contacto eléctrico Mux </td><td> hecho a mano </td><td></td></tr><tr><td> Tira con ocho electrodos serigrafiados (EFE) </td><td> hecho a mano </td><td></td></tr><tr><td> Apoyo especialmente diseñado para bandas de electrodos </td><td> hecho a mano </td><td> Incluye 8 imanes de neodimio de cada uno de ellos se coloca debajo de la superficie de cada electrodo de trabajo de la SPE </td></tr><tr><td> Calibrar pipetas microlitro </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Agitador magnético y barras de agitación. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vasos de vidrio (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Matraces aforados (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 y 2 ml tubos Eppendorf. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Falcon ™ tubos de 5 ml y 15 ml. </td><td> Halcón </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio de Vortex Mixer </td><td></td><td> No utilice vórtex para resuspender perlas magnéticas recubiertas con HT2-KLH o vinculados con la cadena inmunológica para evitar la desnaturalización de las partes proteicas </td></tr><tr><td> Horno de laboratorio o una sala con termostato </td><td></td><td> Elegir un horno capaz de mantener una temperatura de 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Inmunoensayos son una alternativa válida a la que consumen más caro y HPLC cuantitativa o GC 1, 2 métodos de cribado para la detección de micotoxinas peligrosas en los productos alimenticios. En este protocolo se muestra cómo fabricar e interrogar a una enzima vinculada ensayo electroquímicos competitivos inmunomagnética basado en el uso de partículas magnéticas como soporte sólido para la cadena de inmunoquímica 3 y electrodos serigrafiados como la detección de la plataforma. Nuestro método tiene como objetivo determinar la cantidad total de HT-2 y las toxinas T-2, las micotoxinas que pertenecen a la familia de los tricotecenos y de gran preocupación para la salud humana 4. El uso de un anticuerpo clon con una reactividad cruzada del 100% para HT-2 y T-2 permite detectar simultáneamente dos toxinas con una sensibilidad similar 5. El primer paso de nuestro análisis es la etapa de recubrimiento en el que inmovilizar HT2-KLH conjugado toxina en la superficie de partículas magnéticas. Después de una etapa de bloqueo, necesario para evitar absorciones no específicas, la adición de un anticuerpo monoclonal permite la competencia entre los inmovilizados HT-2 y libres presentes HT-2 o T-2 en la muestra o en una solución estándar. Al final de la etapa de la competencia, la cantidad de anticuerpo monoclonal ligado a la inmovilización HT-2 será inversamente proporcional a la cantidad de toxina en la solución de la muestra. Un anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina (AP) se utiliza para mostrar la unión entre el anticuerpo específico y el inmovilizado HT-2. La etapa de medición final se realiza dejando caer una parte alícuota de la suspensión de cuentas magnéticas, correspondientes a una muestra específica / solución estándar, en la superficie de un electrodo serigrafiado de trabajo, partículas magnéticas se inmovilizan y se concentraron por medio de un imán colocado precisamente bajo el serigrafiado de los electrodos. Después de dos minutos de incubación entre partículas magnéticas y un sustrato de la AP, el producto enzimático es detectado por voltametría de pulso diferencial (DPV), utilizando un equipo portátil (PalmSens) también es capaz de iniciar automáticamente ocho mediciones en un intervalo de pocos segundos.

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Un protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interés para la salud humana), utilizando un método de selección de nuevo desarrollo basado en un método competitivo inmunoquímica y un final de la detección electroquímica se demuestra.

ELIME (Enzyme Linked Inmuno magnética químicos) Método para la detección de micotoxinas

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

La detección de ubiquitinación de proteínas

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Investigación

Biología

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

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