Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

Författarna vill tacka Nancy Downer och alla medlemmar från laboratoriet för analytisk kemi, universitetet i Rom &quot;Tor Vergata&quot; för deras samarbete och logistiskt stöd. Detta arbete stöddes av EU-projektet &quot;BioCop&quot;.

1) Blockering belagd magnetiska kulor: Gör så här för att blockera Coated magnetiska kulor: <ol><li> Bered en serie på 2 ml Eppendorf-rör; </li><li> Homogenisera (skaka men inte vortexa) belagd magnetiska kulor (se appendix för beredning av belagd magnetiska kulor) med provet roterande mixern; </li><li> Omedelbart efter homogenisering, Pipettera 10 ìl av belagd magnetiska kulor i varje enskild Eppendorf-rör; </li><li> Tillsätt 1 ml skummjölk blockera lösning i varje Eppendorf-rör...

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

Användningen av antikroppar som biomolekylära erkännande sond har sett en utbredd användning för sensorteknik, immunokemiska upptäckt metoder, såsom Elisa-test och MEIAs, är numera bland de mest använda och tillämpas plattformar i många laboratorier 7. Även om dessa metoder att uppnå exceptionell känslighet och specificitet, ett primärt mål för många forskargrupper under de senaste åren har varit den förbättring och optimering av sina framföranden. <p cla...

Reagenser <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (frivilligt) </td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumdivätefosfat </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dinatriumvätefosfat </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 vattenfri </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31.589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320.331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hydroxymetyl]-aminomethane </td><td> Sigma </td><td> 252.859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albumin bovint serum) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71.290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naphthyl fosfat dinatriumsalt </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Skummjölk blockerande lösningen - inte fett torrmjölk </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2-konjugerat med KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stamlösning (1 mg / ml i PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004.050 </td><td> HT-2-KLH konjugat erhölls genom CDI-metod där den fria OH-grupper på position 3 och 4 vid HT-2-toxin skulle aktiveras av N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) och den aktiverade HT-2-toxin var låt att reagera med aminogroups av proteinet (KLH) för att generera ett stabilt carbammate koppling. </td></tr><tr><td> Sekundär märkt antikropp: anti-mus-IgG (H + L) från häst, konjugerat med alkalisk fosfatas, koncentration 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2-toxin </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnetiska kulor: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Koncentration 2 x 10 9 pärlor / ml. </td></tr></table> Lösningar <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reagensets namn </td><td> Förberedelser </td><td> Kommentarer (frivilligt) </td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 </td><td> Lös 0,20 g kaliumklorid, 0,20 g kaliumdivätefosfat, 1,16 g dinatriumvätefosfat och 8,00 g natriumklorid i 900 ml vatten </td><td></td></tr><tr><td> Dietanolamin buffert, DEA, 0,97 m + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8 </td><td> Lös 0.0476g av MgCl 2 vattenfri och 7.3.59 g KCl i ~ 300 ml vatten. Efter upplösningen lägga till 51 ml av DEA (99,5%). Justera pH till 9,8 med HCl (6 M). Späd till 500 ml med vatten. </td><td></td></tr><tr><td> Boratbuffert, 0,1 M, pH 9,5 </td><td> Lös 3,09 g H 3 BO 3 i ~ 300 ml destillerat vatten, justera pH till 9,5 med NaOH och / eller HCl (6 M eller lägre koncentrationer). Späd till 500 ml med destillerat vatten. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS buffert, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Lös upp 3,85 g av tris [hydroxymetyl]-aminomethane i 100 ml vatten. Justera till ph 8,5 med NaOH och / eller HCl (6 M eller lägre koncentrationer). Späd till 200 ml med vatten. </td><td></td></tr><tr><td> Tris-buffert + BSA-lösning (0,1%), pH 8,4 </td><td> Lös 0,050 g BSA i 50 ml Tris-buffert pH 8,4. </td><td> Denna lösning måste beredas samma dag användning. </td></tr><tr><td> PBS-buffert + Tween ® 0,05% </td><td> Lös 0,250 g Tween 20 i 500 ml av den tidigare beredda PBS-buffert, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS-buffert + BSA-lösning 0,1% </td><td> Lös 0,050 g BSA i 50 ml PBS-buffert, pH 7,3. </td><td> Denna lösning måste beredas samma dag användning. </td></tr><tr><td> PBS-buffert + BSA 0,1% + NaN 3 0,02% </td><td> Lös 0,050 g BSA och 0,010 av NaN 3 i 50 ml PBS-buffert, pH 7,3. </td><td> Förvaring solution </td></tr><tr><td> Enzymatisk substrat </td><td> Lös 0,010 g 1-naphthyl fosfat natriumsalt i 100 ml DEA buffert pH 9,8. Linda kolven hårt i aluminiumfolie. </td><td> Denna lösning måste beredas samma dag användning. </td></tr><tr><td> Skummjölk blockerande lösningen </td><td> Tillsätt 0,20 g Blotting Grade Blocker fettfri torrmjölk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) till 200 ml PBS-buffert pH 7,3. </td><td> Denna lösning måste beredas samma dag användning. </td></tr><tr><td> HT-2-stamlösning </td><td> Lös 10 mg trichothecene HT-2-toxin injektionsflaska, 10 ml acetonitril att ge en lösning med en koncentration på 1 mg / ml. </td><td> Dela upp denna lösning i engångsbruk portioner på 30 ml och lagra dem på mindre än -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 Arbeta standardlösning </td><td> Pipettera 20 ml av HT-2-toxin stamlösningen i en 2 ml kalibrerade mätkolv och späd med acetonitril att få en HT-2-fungerande lösning innehåller 10 mikrogram / ml trichothecene toxin. </td><td> Denna lösning bör beredas samma dag användning. </td></tr><tr><td> HT-2 Arbeta kalibreringsstandard lösningar </td><td> Späd HT-2 arbetar standardlösning (10 mikrogram / ml) för att förbereda arbetar kalibreringsvätska lösning 100 ng / ml. Späd HT-2 arbetar kalibreringsvätska lösning 100 ng / ml för att förbereda arbeta kalibreringsvätska lösningar av följande koncentrationer 0 (tomma), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Dessa lösningar måste beredas på nytt på dagen för användning. </td></tr><tr><td> HT-2-konjugerat med KLH </td><td> Dela upp HT-2-konjugerat med KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stamlösningen (1 mg / ml i PBS) i engångs portioner av 350 l. </td><td> Förvara alikvoter vid -30 ° C. </td></tr><tr><td> Monoklonal antikropp </td><td> Späd 1:350 (v: v) beståndet koncentration (1,383 mg / ml) av monoklonal antikropp i PBS för att använda i konkurrensen steg </td><td> Denna lösning måste beredas på nytt vid tidpunkten för användningen. 10 ml antikroppar stamlösning i PBS för en slutlig volym på 3,5 ml är tillräckligt för att analysera 17 standarder och / eller prover. </td></tr><tr><td> Sekundär Märkta Antibody </td><td> Anti-mus-IgG (H + L) konjugerat med alkalisk fosfatas späds 1:100 (v: v) i PBS för att använda i konkurrensen steg. </td><td> 100 l antikroppar stamlösning i PBS för en slutlig volym på 10 ml är tillräckligt för att analysera 25 standarder och / eller prover. Denna lösning måste beredas på nytt vid tidpunkten för användningen. </td></tr></table> Apparater <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Kommentarer (frivilligt) </td></tr><tr><td> Magnetisk Partikel Concentrator: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens instrument </td><td> PalmSens </td><td> Försedd med PalmSens Lite, Seriell kabel ansluta bärbara dator och Mux alternativ mjukvara </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Åtta kanal Mux elektrisk kontakt </td><td> handgjorda </td><td></td></tr><tr><td> Strip med åtta screentryck elektroder (SPE) </td><td> handgjorda </td><td></td></tr><tr><td> Speciellt utformade stöd för elektroder band </td><td> handgjorda </td><td> Inkluderar 8 neodymiummagneter alla som sitter under varje arbetsdag elektrod yta SPE </td></tr><tr><td> Kalibrerade mikroliter pipetter </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Magnetomrörare och barer rör om. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glasbägare (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mätkolvar (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 och 2 ml Eppendorf-rör. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Falcon ™ rör av 5ml och 15ml. </td><td> Falcon </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorium vortexblandare </td><td></td><td> Använd inte vortexblandare att resuspendera magnetiska kulor täckta med HT2-KLH eller kopplade till immunologiska kedja för att undvika denaturering av proteic delar </td></tr><tr><td> Laboratorium ugn eller termostat rum </td><td></td><td> Välj en ugn kunna hålla en temperatur på 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunologiska metoder ett bra alternativ till dyrare och mer tidskrävande kvantitativa HPLC eller GC 1, 2 metoder för screening upptäcka farliga mykotoxiner i livsmedelsråvaror. I detta protokoll visar vi hur du tillverka och förhöra en elektrokemisk konkurrenskraftig enzymlänkad immunomagnetic analys baseras på användning av magnetiska kulor som fast stöd för immunokemiska kedjan 3 och screentryck elektroder som sensorer plattform. Vår metod är att bestämma den totala mängden HT-2 och T-2-toxiner mykotoxiner tillhör trikotecener familjen och av stor betydelse för människors hälsa 4. Användningen av en antikropp klon med en korsreaktivitet på 100% mot HT-2 och T-2 gör det möjligt att samtidigt upptäcka både gifter med liknande känslighet 5. Det första steget i vår analys är beläggningen steg där vi immobilisera HT2-KLH konjugat gift på ytan av magnetiska kulor. Efter en blockerande steg krävs för att undvika icke-specifik absorptioner, kan tillägg av en monoklonal antikropp konkurrensen mellan immobiliserade HT-2 och gratis HT-2-eller T-2 som finns i provet eller lösta i någon standardlösning. I slutet av tävlingen steg, mängden monoklonal antikropp kopplad till immobiliserade HT-2 kommer att vara i omvänd proportion till mängden toxin i provlösningen. En sekundär antikropp märkt med alkalisk fosfatas (AP) används för att avslöja bindande mellan den specifika antikroppen och den immobiliserade HT-2. Det sista mätningen steget utförs genom att släppa en delmängd av magnetiska pärlor fjädring, motsvarar en specifik prov / standardlösning, på ytan av en screentryckt arbetande elektrod, magnetiska kulor är orörlig och koncentrerad med hjälp av en magnet placeras exakt enligt screentryckt elektrod. Efter två minuters inkubation mellan magnetiska pärlor och ett substrat för AP, är den enzymatiska produkt upptäckts av Differential Pulse Voltammetry (DPV) med ett portabelt instrument (PalmSens) också kunna initiera automatiskt åtta mätningar inom ett intervall på några sekunder.

Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Ett protokoll för att upptäcka trikotecener (mykotoxiner risk för människors hälsa) med hjälp av en nyutvecklad screening metod som bygger på en konkurrenskraftig immunokemisk metod och en slutlig elektrokemisk detektion visas.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrokemiska) Metod för Mykotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

Detektion av protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolering av labil Multi-proteinkomplex av In vivo Kontrollerad Cellular tvärbindning och Immuno-magnetiska affinitetskromatografi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Puls-jakt Analys av N-bundna sockerkedjor från Glycoproteins i däggdjursceller

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Snabb Homogen detektion av biologiska analyser med magnetkamera System Modulation biosensing

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Direkt detektion av acetat-bildande aktivitet av enzymet acetat Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Biotest som screeningmetod för flyktiga ämnen värdväxt

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR är en känslig och snabb metod för detektion av Cytomegaloviral DNA i formalinfixerade, paraffininbäddade Biopsi Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Multi-enzym Screening med hjälp av en hög kapacitet Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Kärnorolering från helvävnad med hjälp av ett rengöringsmedel och enzymfri metod

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Förbereda och föda upp axeniska insekter med vävnadsodlade plantor för värd-tarmmikrobiotainteraktionsstudier av bladbaggen

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...