Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

Yazarlar, işbirliği ve lojistik destek için, Analitik Kimya, Roma Üniversitesi &quot;Tor Vergata&quot; laboratuvar Nancy Downer ve tüm üyelere teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, AB projesi &quot;BioCop&quot; tarafından desteklendi.

1) Engelleme kaplı Manyetik Boncuk: Kaplı Manyetik boncuk engellemek için takip devam edin: <ol><li> 2 ml Eppendorf tüpleri bir dizi hazırlamak; </li><li> (Vorteks sıkıyorlar ama) örnek dönen mikser ile kaplı manyetik bilye (kaplı manyetik boncuk hazırlanması için eke bakınız) homojenize </li><li> Homojenizasyon hemen sonra, her biri ayrı Eppendorf tüp içine kaplı manyetik bilye pipet 10 ul; </li><li> Kümesinin her Eppendorf tüp içine çözümü engelleme yağsız süt ...

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

Biyomoleküler tanıma prob olarak antikorların kullanımı yaygın bir algılama teknolojileri kullanımı gördü; ELISA&#39;larla ve MEIAs immünokimyasal algılama yöntemleri, en çok kullanılan ve uygulanan birçok laboratuvarda 7 platformlar arasında, günümüzde,. Bu yaklaşımların son yıllarda olağanüstü bir duyarlılık ve özgüllük, birçok araştırma grubu birincil hedefi elde ederken, kendi performansları ve iyileştirme ve optimizasyon olmuştur. <p...

Reaktifler <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Potasyum klorür </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum dihidrojen fosfat </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Disodyum hidrojen fosfat </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 susuz </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (% 99.5) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hidroksimetil] aminomethane </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (sığır serum albumin) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> TWEEN 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftil fosfat disodyum tuzu </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Yağsız süt engelleme çözümü olmayan yağlı süt kuru maddesi </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge: </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> HT-2-KLH konjugatı HT-2 toksin pozisyon 3 ve 4 serbest OH grupları N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) ve aktif HT-2 toksin tarafından aktive edilmiştir CDI yöntemi ile elde edildi protein (KLH) aminogroups ile istikrarlı bir carbammate bağ oluşturmak için tepki sağlar. </td></tr><tr><td> İkincil etiketli antikor atı anti-fare IgG (H + L) ile konjuge Alkalen Fosfataz, konsantrasyonu 1 mg / ml. </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 toksin </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Manyetik boncuk: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Konsantrasyon 2 x 10 9 boncuk / ml. </td></tr></table> Çözümler <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Hazırlık </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 </td><td> 900 ml su, 0.20 g, potasyum klorür, potasyum dihidrojen fosfat 0.20 g, 1.16 g disodyum hidrojen fosfat ve 8.00 g sodyum klorür çözülür </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine tampon, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 </td><td> MgCl 2 susuz ve su ~ 300 ml KCl 7.3.59 g 0.0476g çözülür. Dağılmasından sonra 51 ml (% 99.5), DEA ekleyin. HCl (6 M) ile pH 9,8 &#39;e ayarlayın. 500 ml su ile seyreltilir. </td><td></td></tr><tr><td> Borat tamponu, 0.1 M, pH 9.5 </td><td> 3.09 g H 3 BO 3 ~ 300 ml distile su içinde çözülür, NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile 9.5 pH ayarlamak. 500 ml saf su ile seyreltilir. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS tampon, 0.2 M, pH 8.5 </td><td> 3.85 g Tris [hidroksimetil] 100 ml su-aminomethane çözülür. NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile pH 8.5 &#39;e ayarlayın. 200 ml su ile seyreltilir. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS tamponu + BSA solüsyonu (% 0.1), pH 8.4 </td><td> TRIS tampon pH 8,4 50 ml BSA 0.050 g eritin. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> PBS + TWEEN ® 0.05% </td><td> Önceden hazırlanmış PBS, pH 7.4 500 ml 0.250 g TWEEN 20 çözülür </td><td></td></tr><tr><td> PBS + BSA çözüm% 0.1 </td><td> PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA 0.050 g eritin. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> PBS + BSA% 0.1 + NaN 3 0.02% </td><td> PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA g 0.050 ve 0.010 NaN 3, eritin . </td><td> Depolama solution </td></tr><tr><td> Enzimatik substrat </td><td> DEA tampon pH 9.8 100 ml, 0.010 g 1-naftil fosfat sodyum tuzu eritin. Sıkı şişeyi alüminyum folyo ile sarın. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> Yağsız süt bloke çözüm </td><td> Sınıf Engelleyicisi Non-Fat Kuru Süt (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Blot PBS pH 7.3 200 ml 0,20 g ekleyin. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> HT-2 stok solüsyonu </td><td> 10 ml vermek asetonitril, trikotesen HT-2 toksin flakon 10 mg çözülür 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile bir çözüm. </td><td> 30 ml tek kullanımlık alikotları bu çözüm Split ve -30 ° C&#39;den daha az saklayın </td></tr><tr><td> HT-2 standart çözüm Çalışma </td><td> Pipet 20 ml HT-2 toksin stok solüsyonu 2 ml ölçülü balona kalibre ve 10 mg / trikotesenler toksin ml içeren bir HT-2 çözüm elde etmek için asetonitril ile seyreltilmiş. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmalıdır. </td></tr><tr><td> HT-2 Çalışma kalibrant çözümler </td><td> Kalibrant çözeltisi 100 ng / ml hazırlamak için HT-2 standart solüsyonu (10 mg / ml) sulandırınız. Sulandırınız HT-2 kalibrant çözeltisi çalışan 100 ng / ml aşağıdaki konsantrasyonları 0 (boş), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml kalibratörü çözümler çalışmaya hazırlamak için. </td><td> Bu çözümler, kullanım gün taze olarak hazırlanması gerekir. </td></tr><tr><td> HT-2 KLH ile konjuge </td><td> 350 ul tek kullanımlık alikotları KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge Böl. </td><td> -30 ° C&#39;de saklayın alikot </td></tr><tr><td> Spesifik Monoklonal Antikor </td><td> Rekabet adımda kullanmak için PBS monoklonal antikor stok konsantrasyonu (1,383 mg / ml): 1:350 (v v) sulandırınız </td><td> Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. Son bir hacim 3,5 ml PBS 10 ml antikor stok solüsyonu, 17 standartları ve / veya numune analiz etmek yeterli değildir. </td></tr><tr><td> İkincil Etiketli Antikor </td><td> PBS içinde rekabet adımda kullanmak için: Alkalen Fosfataz ile konjuge anti-fare IgG (H + L) 1:100 (v v) seyreltilir. </td><td> Son hacim 10 ml PBS 100 ul antikor stok solüsyonu, 25 standartlara ve / veya numune analiz için yeterli. Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr></table> Cihaz <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens enstrüman </td><td> PalmSens </td><td> Seri kablo bağlantı PC dizüstü bilgisayar ve Mux seçenekleri yazılım PalmSens Lite, ile birlikte verilen </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Sekiz kanal Mux elektrik kontağı </td><td> el yapımı </td><td></td></tr><tr><td> Sekiz serigrafi elektrotlar (SPES) ile sıyırın </td><td> el yapımı </td><td></td></tr><tr><td> Elektrotlar şerit için özel olarak tasarlanmış destek </td><td> el yapımı </td><td> SPE her çalışma elektrot yüzeyinin altında yerleştirilmiş, her biri 8 neodim mıknatıslar </td></tr><tr><td> Kalibreli mikrolitrelik pipetler </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Manyetik karıştırıcı ve heyecan bar. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cam bardak (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volumetrik şişeler (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ve 2 ml Eppendorf tüpleri. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> 5ml, 15ml Falcon ™ tüpleri. </td><td> Şahin </td><td></td></tr><tr><td> Laboratuvar Vorteks Karıştırıcı </td><td></td><td> Proteic parçalarının denatüre önlemek için HT2-KLH ile kaplanmış veya bağlantılı manyetik boncuk immünolojik zinciri ile tekrar süspansiyon vorteks mikser kullanmayın </td></tr><tr><td> Laboratuvar fırın veya mostatlı oda </td><td></td><td> 37 ± 3 ° C lik bir sıcaklık tutmak için bir fırın seçin </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunoassay daha pahalı ve zaman alıcı kantitatif HPLC veya GC 1 2 yöntem, gıda malları tehlikeli mikotoksinler tarama algılama için geçerli bir alternatif. Bu protokolde algılama platformu olarak immünokimyasal zinciri 3 ve serigrafi elektrotlar için sağlam bir destek olarak manyetik boncuk kullanımı dayalı bağlantılı immunomagnetic tahlil imal ve rekabetçi bir elektrokimyasal Enzim sorguya nasıl göstermektedir. Bizim yöntemi HT-2 ve T-2 toksinleri trichothecenes aile ve insan sağlığı 4 için büyük bir endişe ait toplam tutarı, mikotoksinler belirlenmesi amaçlanmıştır. % 100 HT-2 ve T-2 doğru bir çapraz reaksiyon ile bir antikor klon benzer hassasiyet 5 ile aynı anda iki toksinler tespit etmek için sağlar . Testinin ilk adım, biz yüzey üzerinde manyetik boncuk HT2-KLH konjuge toksin hareketsiz kaplama adımdır. Immobilize HT-2 ve HT-2 ya da T-2 örnek ücretsiz mevcut veya standart bir çözüm çözünmüş arasındaki rekabet, non-spesifik emme önlemek için gerekli engelleyici bir adım sonra, monoklonal antikor Ayrıca sağlar. Rekabet adım sonunda, monoklonal antikor miktarı ile bağlantılı HT-2 örnek çözüm toksin miktarı ile ters orantılı olacaktır immobilize. Alkalen fosfataz (AP) ile etiketlenmiş ikincil bir antikor spesifik antikor ve hareketsiz HT-2 arasındaki bağlayıcı ortaya çıkarmak için kullanılır. Son ölçüm adım ekran baskılı bir çalışma elektrot yüzeyinde belirli bir örnek / standart bir çözüm karşılık, manyetik boncuk süspansiyonu bir kısım bırakarak yapılır; altında tam olarak yerleştirilen bir mıknatıs sayesinde manyetik boncuk immobilize ve konsantre ekran basılmış elektrot. Manyetik boncuk ve AP için bir substrat arasında kuluçka iki dakika sonra, enzimatik ürün birkaç saniye bir süre içinde otomatik olarak sekiz ölçümler başlatmak için ayrıca taşınabilir bir enstrüman (PalmSens) kullanarak Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) tarafından algılanır.

Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Trichothecenes (insan sağlığı için endişe mikotoksinler) rekabetçi bir immünokimyasal yöntemi ve bir final elektrokimyasal algılama dayalı yeni geliştirilen bir tarama yöntemi kullanılarak tespit etmek için bir protokol olduğunu göstermiştir.

Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Yaprak Böceğinin Host-Gut Mikrobiyota Etkileşim Çalışmaları için Doku Kültürlü Fidanlarla Aksenik Böceklerin Hazırlanması ve Yetiştirilmesi

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...