Name: preparation of embryos for electron microscopy of the drosophila embryonic heart tube
Uploaded: 2009-12-21T10:00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube at JoVE.com

Nuestro trabajo en la formación del corazón del tubo fue apoyada por la National Science Foundation Grant (ID Premio 0.744.165) para SGK

<ol><li> Recién preparar 2 ml de una solución fijadora contiene 12,5% de glutaraldehído en tampón cacodilato 50 mM (pH 7,4) en un vial de centelleo de 20 ml de vidrio. Añadir 8 ml de n-heptano y agitar vigorosamente. Permitir a las dos fases se separen. Retire la fase superior que contiene n-heptano saturado con glutaraldehído, el lugar en un vial de centelleo limpio y dejar de lado. Esta será la solución fijadora. </li><li> Recoger embriones 00-20 horas usando una cámara de recogida de embriones, que es una pequeña cesta con una inserción de malla extraíble. Quitar la membrana externa del corion por inmersión de embriones en una solución de lejía al 50% durante 2-3 minutos, o hasta que los embriones flotan en la superficie de la lejía. Enjuague bien con embriones ddH20 y mancha en una toalla de papel. </li><li> Con unas pinzas, recoja el tamiz que se cubre con embriones dechorionated y lugar en la solución de fijación, lo que permite embriones a caer de la malla. Permita que los embriones para fijar durante 1,5 horas a 4 ° C mientras se mezcla en un Nutator. </li><li> Prepare una placa de Petri llena de cinta de doble cara. Eliminar embriones del fijador con una pipeta Pasteur y colocarlos sobre una superficie grabada de Petri dish.Transfer los embriones en una cantidad mínima de solución fijadora para evitar que el heptano en el fijador de disolver el pegamento de la cinta. Agitar la placa de Petri para hacer una sola capa de embriones. Coloque una placa de Petri en la campana hasta que se evapore heptano. Añade suficiente Tween20 PBS + 0,1% para cubrir los embriones. Devitellinize mano etapa tardía de 16 embriones en un microscopio con una aguja de tungsteno contundente. Recuperar los embriones con una pipeta Pasteur a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Los pasos 5-7 se llevan a cabo en este tubo de microcentrífuga. </li><li> Enjuague los embriones en 0,1 M cacodilato, pH 7,4 y después de fijar en una solución que contiene 1% de tetróxido de osmio en 0,1 M cacodilato tampón, pH 7,4 durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague los embriones con 0,1 M cacodilato, pH 7,4. </li><li> Deshidratar los embriones en una serie gradual de etanol y acetona. Deshidratar embriones con un 50% de etanol durante 10 minutos, seguido por el 70% de etanol durante 10 minutos. Luego se deshidratan en un 90% de acetona durante 10 minutos, y dos pasos de 100% de acetona de 10 minutos cada uno. </li><li> Eliminar la acetona y luego comenzar el proceso de infiltración mediante la adición de una relación 1:1 Epon-resina Spurr: mezcla de acetona a los embriones. Microondas durante tres minutos con un Pelco Biowave microondas Pro, manteniendo la muestra bajo la presión de vacío. Aplicar presión de vacío para la muestra por otros cinco minutos después de la microonda ha terminado. Intercambio de las 1:01 de resina, la mezcla de acetona con Epon-Spurr resina 100% y de microondas de nuevo bajo la presión de vacío. Cambio del 100% Epon-resina Spurr por última vez, y microondas bajo la presión de vacío. </li><li> Con una pipeta Pasteur, los embriones se transfieren desde el tubo de microcentrífuga a un molde de silicona incrustación. Alinear los embriones en una fila de tal manera que el extremo posterior del embrión se alinea con el borde afilado del molde. Hornear en un horno de 70 º C durante la noche. </li><li> Quitar la muestra y prepararse para el corte. </li><li> Comenzar a recortar las secciones con un diamante de 1μm Histo cuchillo y Richert Ultracut E microtomo. Tome nota de que la sección de primer embrión es alcanzado. Desde este punto, corte 100μm en la muestra. Remover una sección con un bucle, y el lugar en un portaobjetos de vidrio. En pocas palabras el calor de la sección en un plato caliente. Tinción de la sección con una gota de azul de metileno. Bajo un microscopio de luz identificar la luz del corazón. </li><li> Los cortes de secciones de 90nm con un ultra Diamante 45 ° Cuchillo y Richert Ultracut E microtomo. Recoger varias secciones en una rejilla de cobre. </li><li> Las rejillas son teñidas con acetato de uranilo al 3% saturada en etanol al 50% durante diez minutos y luego enjuagar tres veces con agua destilada. Entonces, las redes están manchadas con citrato de plomo (0.04gms disuelto en 10 ml de agua destilada doble y 100 ml de NaOH 10M) durante 2,5 minutos en una cámara que contiene gránulos de NaOH para crear un CO 2 libre de medio ambiente. Las rejillas se lavaron tres veces con agua destilada. </li><li> Las secciones se examinaron con un microscopio electrónico JEOL 1200EX a 80kV, y se fotografiaron con una cámara digital de AMT. </li></ol>

<ol>
	<li>Tepass, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Cellular+Junctions+in+the+Drosophila+embryo.">The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsion+by+Slit+and+Roundabout+prevents+Shotgun/E-cadherin-mediated+cell+adhesion+during+Drosophila+heart+tube+lumen+formation.">Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation.</a> J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).</li></ol>

La morfogénesis del tubo cardíaco embrionario de Drosophila se ha convertido en un sistema modelo valioso para el estudio de la adhesión celular y cambios en las células forma durante el desarrollo embrionario. Uno de los desafíos que enfrentan en el estudio de esta estructura es que la luz del tubo cardíaco es difícil de visualizar en los embriones de montaje en su conjunto. La técnica se demuestra en este vídeo, que es una adaptación de los procedimientos anteriormente descritos 1-2, ha demostrado ser exitoso en forma eficiente y fiable el análisis de un gran número de genotipos para el tubo de corazón y la formación del lumen 3.

preparation of embryos for electron microscopy of the drosophila embryonic heart tube

La morfogénesis de la<em&gt; Drosophila</emTubo&gt; corazón embrionario se ha convertido en un sistema modelo valioso para estudiar la migración celular, la adhesión célula-célula y cambios en las células forma durante el desarrollo embrionario. Uno de los desafíos que enfrentan en el estudio de esta estructura es que la luz del tubo cardíaco, así como las características de la membrana que son cruciales para la formación del corazón del tubo, son difíciles de visualizar en los embriones de montaje en su conjunto, debido al pequeño tamaño del tubo cardíaco e intra-luminal del espacio en relación con el embrión. El uso de la microscopía electrónica de transmisión permite una mayor ampliación de estas estructuras y da la ventaja de examinar los embriones en la sección transversal, que revela fácilmente el tamaño y la forma de la luz. En este video, se detalla el proceso para la fijación fiable, inclusión, y la sección de la etapa terminal<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones con el fin de visualizar la luz del tubo del corazón, así como importantes estructuras celulares, incluyendo las uniones célula-célula y la membrana basal.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube at JoVE.com

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Se describe un proceso para la fijación, inclusión, corte, y las imágenes de la etapa terminal<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones de Microscopía Electrónica Trasmission del tubo cardíaco embrionario. Esta técnica permite la visualización de la luz del tubo del corazón, así como de la membrana basal, que recubre la luz del corazón.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Investigación

Biología

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Marcaje fluorescente de Drosophila Estructuras del Corazón

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizar el corazón latiendo en Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Drosophila Preparación e Imagen longitudinal de la función cardiaca in vivo utilizando microscopía de coherencia óptica (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...