Name: dual somatic recordings from gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neurons identified by green fluorescent protein (gfp) in hypothalamic slices
Uploaded: 2010-02-23T17:20:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices at JoVE.com

أنا ممتن لرونالد لام كالابريس ، ديتر جايجر (جامعة إيموري) وارد Yuhas (أكسون الآلات) لإجراء مناقشات تقنية مفيدة.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد شرائح الدماغ طائي ، حضنت ونقل إلى غرفة تسجيل كما هو مفصل في السابق (9) في الحيوانات التي GnRH الخلايا العصبية عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة المروج الببتيد GnRH (10). بعد إزالة الدماغ من الحيوان ، ويتم حظر الدماغ باستخدام شفرة حلاقة للقضاء على المناطق التي ليست ذات فائدة. من أجل تحديد المناطق لإزالة ، وضعت في الدماغ على سطحه الظهري بحيث يمكن تصور ما تحت المهاد. لكل من توجهات شريحة الاكليلية والسهمي ، تتم إزالة المخيخ. لإعداد شريحة الاكليلية ، تتم إزالة جزء من القشرة منقاري. هذا التوجه في شريحة والمناطق الجانبية من القشرة تقديم الدعم لتشريح الدماغ وتوفير مساحة كافية من الدماغ لوضع أسلاك الفضة لتأمين الدماغ في غرفة تسجيل. لإعداد شريحة السهمي ، يتم إزالة المناطق الجانبية من الدماغ وأجزاء من القشرة منقاري تقديم الدعم لتشريح الدماغ ووضع أسلاك الفضة لتأمين الدماغ في تسجيل جيدا. طوال إجراءات حظر باستمرار الدماغ مبلل بالماء البارد السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) باستخدام ماصة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع كمية صغيرة من Superglue على منصة القطع. رفع الدماغ مع ملعقة. تتم إزالة ACSF الزائد عن طريق جلب Kimwipe إلى السطح من ملعقة والرسم ACSF الزائدة بعيدا عن الدماغ. وبلطف الدماغ تراجعت إلى الأمام على الغراء. فمن المهم عدم لمس أو دفع أسفل الدماغ على ذلك من أجل تأمين ذلك. وزن الدماغ نفسه هو عادة ما تكون كافية لضمان أنها آمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تأمين الدماغ والنظام الأساسي لقطع مشراح تهتز بشكل جيد وقطع مليء ACSF الباردة. الحل الباردة على حد سواء شركات الدماغ ويمكن أن تحمي من التلف أثناء عملية القطع. مناطق الدماغ المختلفة تتفاوت في درجة برودة أن يحسن نوعية شرائح. درجة حرارة ACSF لإعداد شرائح طائي عموما 0 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تقطع شرائح كل شريحة ببطء وينبغي أن تطفو بحرية بعيدا عن الدماغ. إذا شرائح تبدأ خلال خفض حليقة ، ينبغي تباطأ السرعة التي تتقدم النصل. يمكن للمرء أن استخدام فرشاة الدهان الصغيرة لشرائح uncurl لكن هذا لا خطر الإضرار شرائح وبالتالي يجب تجنبها. ببطء ويفضل سرعة قبل أن نصل خلال استخدام فرشاة الدهان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو قطع كل شريحة من الدماغ ، وسحبه من الغرفة قطع وتوضع في غرفة الحضانة شريحة في حمام ماء دافئ (حوالي 32 درجة مئوية). يتم توفيره باستمرار الحاضنة شريحة مع الأكسجين باستخدام مزيج من 95 ٪ O 2 و 5 ٪ CO 2. عموما ، ما قبل الحضانة شريحة تتراوح من تسجيل 30 دقيقة إلى 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي ملفقة الزجاج الماصات (3-6 MΩ) كما هو موضح سابقا (9) باستخدام مجتذب العمودي. تختلف بحسب درجة الحرارة ومدة سحب على نوع يستخدم ماصة one مجتذب ، ونوع يستخدم كوب واحد وعمر خيوط تسخين مجتذب. يمكن للشكل غيض ماصة تختلف أيضا حسب تفضيل المستخدم. لقد حققنا نجاحا طيبا مع طرف مدبب بشكل موحد مع افتتاح 0.1 ملم. أكبر الفتحات الموجودة في ماصة تميل إلى تلف الخلايا العصبية في حين أن أصغر الفتحات نتيجة فشل في تسجيلات مدة طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصات Sylgard مغطاة للحد من السعة. ومغلفة بخفة مع نصائح ماصة سحبت 184 Sylgard باستخدام ماصة الثانية. نصائح Sylgarded ثم يتم الشفاء للحرارة باستخدام بندقية الحرارة. ثم يتم ملء هذه ماصات سائل الإرواء مع الحمام. لزيادة التصور من النصائح ماصة ، يتم إضافة كمية صغيرة من اليكسا - 568 إلى جزء من الحل الحمام لاستخدامه كحل ماصة قبل ملء الماصات. نحن لا تزن اليكسا - 568 ولكن استخدام بدلا يكفي لتحويل الوردي حل عن طريق العين. يمكن أن تكون نصائح ماصة ثم تصور تحت التصفية الحمراء ولاية تكساس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد طورنا نهجا للحصول على تسجيلات المشبك الجاري للكشف عن امكانات العمل به أختام مقاومة منخفضة (انظر المناقشة). تتم التسجيلات في المحتملة للخلية يستريح الذاتية مع Axoclamp لا يطبق الصك الحالي أكسون به في 2B. ومع ذلك ، ويرجع ذلك إلى انخفاض المقاومة الختم ، يمكن للمرء أن لا يكشف عن امكانات العمل مع مكبر للصوت فقط 2B. لزيادة إشارة ، يتم استخدام مكبر للصوت الثاني (نظم AM 3000) في سلسلة مع 2B Axoclamp. هذا النهج لديه سهولة الأختام فضفاضة وفائدة على المدى الطويل التسجيلات. تقنيا ، يمكن للمرء قياس إمكانات مباشرة العمل ، وبالتالي الالتفاف على المشاكل مع النهج المتبع في وضع تسجيل الجهد المشبك (انظر مناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد يأخذ اثنين ماصات على سطح الخلايا العصبية المختارتين سابقا في الوقت نفسه ، بطريقة مشابهة لنهج لتكوين خلية تسجيل بأكملها. تقترب كلا شمال شرقوقد urons في الوقت نفسه أكثر نجاحا في الحصول على تسجيلات المزدوج من محاولة كل عصبون من الزوج بشكل مستقل. خلال هذا الوقت ، يتم تمرير البقول الحقن الحالية من مكبر للصوت 2B كما هو الحال خلال نهج لكامل الخلية التسجيلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب المحافظة على الضغط الايجابي على كل من الماصات لمنع انسداد رأس. يتولد ضغط إيجابية لأفضل التسجيلات المزدوجة باستخدام شاغرة حقنة فارغة 3 مل تعلق على حامل ماصة من طول قطعة من الأنبوب. باستخدام الحقن يسمح احد للحفاظ على الضغط على كل من الماصات. وينبغي تطبيق الضغط الايجابي في أقرب وقت كما تم وضع ماصة في حل حمام غرفة تسجيل. واحد يقترب من الخلايا العصبية المحددة مع ماصات بالتسلسل. بعد تحديد المواقع ماصة first مباشرة عبر أكبر سطح الخلايا العصبية ، واحدة تحتفظ إيجابية من خلال ترك في مكان الحقنة ويترك ماصة في هذا الموقف. واحد ثم عاد إلى الجزء العلوي من غرفة تسجيل ويخفض ماصة الثاني في تسجيل موقف. تحديد الخلايا العصبية وغالبا ما تكون على مستويات مختلفة من شريحة. وينبغي وضع ماصة الاول على الخلايا العصبية التي هي أعمق في شريحة وموقف ماصة الثانية في الخلايا العصبية أكثر سطحية. هذا يمنع المواقع من ماصة الثانية من تحويل المواقع من ماصة المرتبة الثانية من حيث الشريحة سوف تتحرك قليلا في الطائرة العمودية وماصات دخول شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسيتم استخدام الأختام فضفاضة (18-30 MΩ). فإن الضغط الايجابي لحث على نقرة صغيرة على سطح كل خلية. واحد يحاول ختم عصبون الاولى بالافراج عن الضغط الايجابي وتطبيق ضغط سلبي طفيف جدا. يتم تحرير الضغط الايجابي عن طريق إزالة المحقنة. ثم يتم تطبيق شفط عن طريق الفم إلى نهاية الحرة للأنابيب. وغشاء الخلية العصبية السليم الاستجابة بسرعة لإطلاق سراح من الضغط الايجابي والالتزام ماصة. سوف شفط طفيف شكل خاتم مع المقاومة المناسبة في الخلايا العصبية السليمة. </li> <li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند واحد يحاول ابرام الخلايا العصبية وفشل ، لا يمكن أن يعاد ماصة تستخدم منذ الأغشية الختم جدا فقط لتنظيف الزجاج. بدلا من ذلك ، واحد يرفع ماصة (والهدف المجهر) بعيدا عن سطح الشريحة إلى أعلى نضح جيدا ، ويزيل ماصة من الحمام ، وتغييرات على ماصة نظيفة ثم يعود إلى شريحة محاولة ختم خلية أخرى . لهذه الأسباب ، فمن المهم لتحديد الخلايا العصبية المحتملة متعددة للتسجيلات. للشرائح التي يقل عدد الخلايا العصبية 4-6 جودة التسجيل من الذي يختار ، والنجاح في الحصول على تسجيلات المزدوج محدودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إنشاء ختم فضفاض على أساس المقاومة ، وإنهاء البقول الحقن الحالية من مكبر للصوت 2B. يتم وضع amplifer 2B في سلسلة مع سلسلة amplifer 3000. في هذا التكوين ، وإخراج amplifer 2B بمثابة مدخلات للamplifer سلسلة 3000. ويوفر هذا الأخير amplifer إشارة للحصول على البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتكرر ثم ختم (الخطوة 4) وإعادة تشكيل amplifers (الخطوة 5) لعصبون الثانية. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" /> الشكل 1. زادت فترة من اطلاق النار في اثنين من الخلايا العصبية باستخدام GnRH فضفاضة التكوين ختم التسجيل المرفقة في إعداد شريحة السهمي. استمدت شريحة من ذكر مخصي. كل انعطاف صاعد يشير إلى إمكانات العمل. علما بأن أحد GnRH الخلايا العصبية (آثار أعلى) المعارض اطلاق النار مستمر تقريبا في حين أن الثانية GnRH عصبون المعارض رشقات نارية متقطعة. هذا النمط من النشاط من الخلايا العصبية GnRH واحدة مماثلة لتلك التي واحدة من وحدات متعددة المستخرجة من تسجيلات وحدة خلال إفراز هرمون في الجسم الحي (7). الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

<ol>
	<li>Silverman, A. J., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gonadotropin+releasing-hormone+(GnRH)+neuronal+systems:+immunocytochemistry.">The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Freeman, M. E., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+control+of+the+ovarian+cycle+of+the+rat.+In:+The+physiology+of+reproduction.">The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat. In: The physiology of reproduction.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Belchetz, P. E., Plant, T. M., Nakai, Y., Keogh, E. J., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypophysial+responses+to+continuous+and+intermittent+delivery+of+hypopthalamic+gonadotropin-releasing+hormone.">Hypophysial responses to continuous and intermittent delivery of hypopthalamic gonadotropin-releasing hormone.</a> Science. 202, 631-633 (1978).</li><li>Maurer, J. A., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luteinizing+hormone-releasing+hormone+quantified+in+tissues+and+slice+explant+cultures+of+postnatal+rat+hypothalami.">Luteinizing hormone-releasing hormone quantified in tissues and slice explant cultures of postnatal rat hypothalami.</a> Endocrinology. 140, 791-799 (1999).</li><li>Harris, G. C., Levine, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pubertal+acceleration+of+pulsatile+gonadotropin-releasing+hormone+release+in+male+rats+as+revealed+by+microdialysis.">Pubertal acceleration of pulsatile gonadotropin-releasing hormone release in male rats as revealed by microdialysis.</a> Endocrinology. 14, 163-171 (2003).</li><li>Sisk, C. L., Richardson, H. N., Chappell, P. E., Levine, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gonadotropin-releasing+hormone+secretion+in+female+rats+during+peripubertal+development+and+on+proestrus.">In vivo gonadotropin-releasing hormone secretion in female rats during peripubertal development and on proestrus.</a> Endocrinology. 142, 2929-2936 (2001).</li><li>Cardenas, H., Ordog, T., O'Byrne, K. T., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+unit+components+of+the+hypothalamic+multiunit+electrical+activity+associated+with+the+central+signal+generator+that+directs+the+pulsatile+secretion+of+gonadotropic+hormones.">Single unit components of the hypothalamic multiunit electrical activity associated with the central signal generator that directs the pulsatile secretion of gonadotropic hormones.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 9630-9634 (1993).</li><li>Silverman, A. J., Wilson, R., Kesner, J. S., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+localization+of+multiunit+electrical+activity+associated+with+pulsatile+LH+release+in+the+rhesus+monkey.">Hypothalamic localization of multiunit electrical activity associated with pulsatile LH release in the rhesus monkey.</a> Neuroendocrinology. 44, 168-171 (1986).</li><li>Roberts, C. B., O'Boyle, M. P., Suter, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrites+determine+the+contribution+of+after+depolarization+potentials+(ADPs)+to+generation+of+repetitive+action+potentials+in+hypothalamic+gonadotropin+releasing-hormone+(GnRH)+neurons.">Dendrites determine the contribution of after depolarization potentials (ADPs) to generation of repetitive action potentials in hypothalamic gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neurons.</a> J Comput Neurosci. 26, 39-53 (2009).</li><li>Spergel, D. J., Kruth, U., Hanley, D. F., Sprengel, R., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-+and+glutamate-activated+channels+in+green+fluorescent+protein-tagged+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+transgenic+mice.">GABA- and glutamate-activated channels in green fluorescent protein-tagged gonadotropin-releasing hormone neurons in transgenic mice.</a> J Neurosci. 19, 2037-2050 (1999).</li><li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL/6J+mice:+I.+Cycle+frequency,+length+and+vaginal+cytology.">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biol Reprod. 27, 327-339 (1982).</li><li>Gee, D. M., Flurkey, K., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+the+regulation+of+luteinizing+hormone+in+C57BL/6J+mice:+impaired+elevations+after+ovariectomy+and+spontaneous+elevations+at+advanced+ages.">Aging and the regulation of luteinizing hormone in C57BL/6J mice: impaired elevations after ovariectomy and spontaneous elevations at advanced ages.</a> Biol Reprod. 28, 598-607 (1983).</li><li>Anson, B. D., Roberts, W. M., Walz, W., Boulton, A. A., Baker, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch+voltage-clamp+technique.">Loose-patch voltage-clamp technique.</a> Neuromethods, Patch-clamp analysis: Advanced techniques. 35, 265-286 (2002).</li><li>Calabrese, B., Tabarean, T., Juranka, P., Morris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitivity+of+N-type+calcium+channel+currents.">Mechanosensitivity of N-type calcium channel currents.</a> Biophys J. 83, 2560-2574 (2002).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+single+neurons+by+irradiation+of+intracellularly+injected+dye.">Rapid killing of single neurons by irradiation of intracellularly injected dye.</a> Science. 206, 702-704 (1979).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J Physiol. 550, 159-167 (2003).</li></ol>

نشاط الخلايا العصبية في بعض المصالح بما في ذلك الخلايا العصبية GnRH (استنادا إلى إفراز هرمون) تحدث على فترات زمنية من ساعات (5-7). لذلك ، تكوين خلية كاملة ليست هي الخيار الأفضل لبعض الأهداف التجريبية نظرا لغسيل الكلى من رسل الخلايا في وضع خلية تسجيل بأكملها. ثانوي ، تقتصر عموما خلية كاملة تسجيلات للحيوانات تقل عن 120 يوما من العمر. مع التقدم في العمر ، والأغشية العصبية ويبدو أن تشديد ، مما يجعل من الصعب مقاومة عالية الاختام لتحقيقه. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان أحد يحصل على ختم مقاومة عالية ، وتمزق التصحيح يعطل الختم ، وترك حفرة بين ماصة والأغشية. هذا يؤدي إلى تسجيل غير صالحة للاستعمال والخلايا العصبية التي تموت بسرعة بسبب الاختلالات الأيونية. دورات منتظمة المبيض ، وبالتالي ، والنشاط المستقر للمولد النبض GnRH لا يحدث إلا في وقت لاحق في الحياة (7-10 شهرا من العمر في C57Bl6 الإناث ، 11 ، 12) ، وأبعد من العمر عندما يمكن للمرء أن يتوقع الحصول على نحو معقول كامل الخلية التسجيلات صحيح. أخيرا ، خلية كاملة التسجيلات تدمير الذاتية نسب تركيزات أيون الداخلية والخارجية. مع تسجيلات خلية كاملة ، وتركيز أيون الداخلية لأي يساوي تركيز أيون في حل ماصة. هذا هو الحل لأن ماصة من حيث الحجم الكبير نسبيا تصل بسرعة التوازن مع / يستبدل الحجم الصغير نسبيا الداخلية للخلية. نهج الخلية فضفاضة يعلق تلتف حول العديد من القيود المفروضة على كامل الخلية التسجيلات. أولا ، يمكن استخدام ختم مقاومة منخفضة (15-30 MΩ). هذه هي سهلة نسبيا لتشكيل الخلايا العصبية حتى في كبار السن من الحيوانات. وثانيا ، فإن المرء لا تمزق غشاء مختومة من التصحيح. ولذلك ، والتسجيلات الخلية فضفاضة المرفقة فنيا أسهل بكثير من خلية كاملة التسجيلات. بالإضافة إلى ذلك ، لأن غشاء الخلية سليمة ، وغسيل الكلى لمكونات الخلايا لا تحدث ، ويتم الحفاظ على نسب الأيونية الذاتية. لا يمكن للمرء استخدام نهج الخلية فضفاضة يعلق لدراسة التيارات متشابك لكنه يعتبر مثاليا لمدة طويلة الأجل من الخلايا العصبية في التسجيلات بطريقة غير الغازية نسبيا. ويمكن أيضا الخلية التسجيلات المرفقة به أن يتم تنفيذ أي حل في مستوى الخلايا الماصة. هذا يوفر ميزة إضافية تتمثل في تمزق غشاء التصحيح عند اكتمال تسجيل المدى الطويل ، ووصفها عصبون مع علامة داخل الخلايا. وقد استخدم نهج الخلية فضفاضة يعلق في وضع تسجيل الجهد المشبك. ومع ذلك ، الجهد المشبك تسجيل في تكوين الخلية فضفاضة يعلق لديه مشاكل منهجية عديدة. أولا ، الإشارات المسجلة هو مقياس غير مباشر من النشاط. في إشارة إلى أن يقاس (كما يسمى العمل الحالية) هو بالسعة الحالية التي تهم الغشاء (13). هذه مسألة في غاية الأهمية المنهجية. يمكن أن السعة والمقاومة لماصة تسجيل تصفية الإشارات المسجلة. فمن المحتمل جدا أن تضيع تيارات العمل في شحن صغيرة السعة للماصة التي لا يمكن تعويضها بشكل صحيح مع معظم مكبرات الصوت ، وذلك بسبب مقاومة عالية للheadstage. عندما تذهب هذه الاشارات التي لم يتم كشفها ، ونمط واضح لإطلاق الخلايا العصبية لا تعكس نمط اطلاق صحيحا. وبالمثل ، ماصة بدون تعويض والمقاومات ختم تؤدي إلى أخطاء كبيرة في القياسات خلال إجراء تغييرات مثل عندما يتم التعبير عن تيارات العمل (13). بعض مكبرات الصوت توفير السعة والمقاومة &quot;التعويض&quot; للماصة والختم ، مما يحد من فقدان إشارة ، ولكنها مرتفعة مراحل رأس المقاومة لمعظم مكبرات الصوت تعيق التعويض الأمثل. ثانيا ، فرض حالة مصطنعة على الخلية. في الجهد المشبك واسطة ، ويقام في المنطقة المحيطة غشاء الخلية لإمكانات الثابتة ، في هذه الدراسات ، 0 بالسيارات. هذا لا يعني عدم وجود الحالية تطبق على غشاء الخلية. إشارة قياس الفولتية في المشبك هو في الواقع كمية الحالية المطبقة على الغشاء للحفاظ على القدرة الثابتة. لذلك ، يمكن تطبيق هذا التيار يغير من نشاط الخلايا. تسجيلات المزدوج في نظام GnRH وتحديا من نوع خاص نظرا لعدد محدود من الخلايا العصبية GnRH وتوزيعها منتشر. للتسجيلات المزدوج لتكون ناجحة ، يجب أن تكون مستقرة جدا تتلاعب. حتى يمكن للحركة طفيفة في القطب السبب ماصة لخلع الخلايا العصبية ونهاية التسجيل. وعلاوة على ذلك ، يمكن للحركة ماصة على الخلية (على سبيل المثال ، وإعادة تحديد المواقع للتعويض عن الحركة) تغيير أنماط اطلاق النار. بعض هذه القنوات قنوات أيون الكالسيوم من نوع N حساسة ميكانيكيا : تمدد الغشاء يسبب النشاط المتكررة في تكوينات تسجيل كل من كامل الخلية والخلية المرفقة - (14). أخيرا ، يجب على النظام تتلاعب تكون قادرة على الحركة الدقيقة للغاية وسلسة. كما أشير أعلاه ، مع تسجيلات مزدوجة ، واحدة يأخذ اثنين ماصات على سطح الخلايا العصبية المختارتين سابقا في نفس الوقت ومحاولات لاغلاقعصبون. في حال نجاحها ، ثم واحد يحاول ختم الخلية الثانية. عموما ، يمكن للمرء أن لا نتوقع أن يكون ختم وتسجيل عالية الجودة مع كل محاولة. هذا ، ومع ذلك ، ويخلق مشكلة خاصة مع التسجيلات المزدوجة. إذا كان أحد غير ناجحة مع الخلايا العصبية الأولى ولكن مع فشل الثاني ، لا بد من تغيير ماصة ومحاولة خلية مختلفة. لذا ، يجب على المرء أن يكون قادرا على نقل كل هدف غمر المجهر وماصة للفي الجزء العلوي من نضح جيدا (لتغيير ماصة) دون تعطيل الخلايا العصبية مختومة بنجاح. تنميتنا واستخدام نهج الخلية المرفقة فضفاض للتسجيلات المزدوج يمثل تقدما كبيرا في دراسة الخلايا العصبية التقنية GnRH. فمن المرجح أن تسفر عن نتائج مفيدة من شأنها أن تساعد في تحريك الحقل إلى الأمام في سياق السؤال الحاسم عما الآليات الكامنة وراء النشاط المنسق أن النتائج في إفراز هرمون نابض.

dual somatic recordings from gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neurons identified by green fluorescent protein (gfp) in hypothalamic slices

موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (GnRH) هو الذي ينظم neuropeptide صغيرة من هرمون الغدة النخامية الافراج اللوتيني والهرمون المنبه للجريب (FSH). الجونادوتروبين هذه ضرورية لتنظيم وظيفة الإنجاب. وتوزع على الخلايا العصبية التي تحتوي على GnRH منتشرة في جميع أنحاء منطقة ما تحت المهاد والمشاريع البارزة في الوسط حيث يطلقون GnRH من محطات محوار بهم في نظام البوابة نخامي التوجه) 1 (. الشعيرات الدموية في المدخل ، GnRH يسافر إلى الغدة النخامية لتحفيز إطلاق سراح الجونادوتروبين إلى الدوران الجهازي. GnRH الإفراج مستمر ولكن لا يحدث في البقول بدلا العرضية. ومن الثابت أن الطريقة متقطعة من اطلاق سراح GnRH ضروري لاستنساخ (2 ، 3). تنسيق نشاط الخلايا العصبية GnRH متعددة ربما يكمن وراء GnRH البقول. إجمالي محتوى الببتيد في الخلايا العصبية ما يقرب من 1.0 GnRH الغرام / خلية (4) ، والتي تضم 30 ٪ من المحتمل تجمع نشره. مستويات GnRH خلال نبضة (5 ، 6) ، وتشارك ربما توحي GnRH متعددة في الخلايا العصبية neurosecretion. وبالمثل ، واحد وحدة النشاط المستخرجة من تسجيلات متعددة الوحدات طائي في أثناء فترة الإفراج LH يشير إلى تغييرات في نشاط الخلايا العصبية متعددة (7). وترتبط الأقطاب مع النشاط المسجل خلال نبضات LH إما مع somata GnRH أو الألياف (8). لذلك ، على الأقل بعض من هذا النشاط ينشأ من الخلايا العصبية GnRH. الآليات التي تؤدي إلى إطلاق متزامنة في الخلايا العصبية GnRH طائي غير معروفة. توضيح آليات تنسيق اطلاق النار في الخلايا العصبية GnRH مشكلة معقدة. أولا ، GnRH الخلايا العصبية هي قليلة نسبيا من حيث العدد. في القوارض ، وهناك 800-2500 GnRH الخلايا العصبية. ليس من الواضح أن تشارك جميع الخلايا العصبية في اطلاق سراح GnRH GnRH العرضية. وعلاوة على ذلك ، يتم توزيع منتشرة GnRH الخلايا العصبية (1). أدى هذا إلى تعقيد فهمنا للتنسيق اطلاق النار ، وجعلت العديد من المناهج الفنية مستعصية على الحل. ونحن فضفاضة الأمثل الخلية المرفقة التسجيلات في وضع المشبك الجاري للكشف عن مباشرة العمل ، وإمكانيات وضع نهج التسجيل التي يسمح للتسجيلات في وقت واحد من أزواج من الخلايا العصبية GnRH.

Watch this Scientific Journal Video about Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices at JoVE.com

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

النشاط في النظم العصبية وغالبا ما يتطلب العمل التصريف متزامن المحتملة من الخلايا العصبية داخل مجموعة سكانية محددة. على سبيل المثال ، نبضات موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (GnRH) المرجح أن يتطلب تنسيق النشاط بين الخلايا العصبية GnRH. نقدم أسلوبنا المنهجي للحصول على تسجيلات موثوق بها في وقت واحد من الخلايا العصبية الكهربية في GnRH توزيع منتشرة.

المزدوج من تسجيلات الجسدية لإفراز هرمون موجهة الغدد التناسلية (GnRH) الخلايا العصبية التي تم تحديدها بواسطة بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في شرائح طائية

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

في وقت واحد من تسجيل إشارات الكالسيوم من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وسلوك التغذية من ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

التحت خلوية تسجيلات التصحيح، المشبك من المجال Somatodendritic من سودائي الدوبامين العصبية

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...