Name: murine model of cd40-activation of b cells
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Vi tackar vänligt Dr Clemens Wendtner för att ge tmuCD40-ligand-HeLa cellinje.

Protokollet för generering av murina CD40-aktiverade B-celler (mCD40B) från splenocytes är uppdelad i två delar: Del A visar att förbereda murina CD40 ligand (CD40L) som uttrycker HeLa celler (tmuCD40L HeLa), som kommer att användas som plåt- bundet feeder celler. Del B beskriver det faktiska murin CD40-B-kultur. A. Beredning av feeder celler (tmuCD40L HeLa) Den tmuCD40L HeLa är en anhängare mänskliga epitelceller linje, som aldrig skulle bli helt sammanh...

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

Ändringar av detta protokoll är möjliga, särskilt när det gäller ursprunget till CD40-stimulans och vilken typ av mus stam som används, även ger en effektiv generering av murina CD40-aktiverade B-celler. Ahmadi et al. har visat liknande resultat för musfibroblaster transfererats med murina CD40-ligand. I detta sammanhang presentation av xeno-antigen kan uteslutas med säkerhet, men intensiva studier avseende säkerhet och toxicitet in vivo gav inga tecken på inflammation eller autoimmunitet reaktion i...

A. Beredning av medier: <table border="1"><tbody><tr><td> Feeder cell vildtyp medelstora </td><td> Feeder cellmarkeringen medelstora </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Koncentration </td><td> Reagens </td><td> Koncentration </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> 300 mikrogram / ml </td><td> L-glutamin </td><td> 300 mikrogram / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 mikrogram / ml </td><td> Gentamycin </td><td> 15 mikrogram / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycin B </td><td> 0,2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B tvätt medelstora </td><td> mCD40-B odlingsmedium </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Koncentration </td><td> Reagens </td><td> Koncentration </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> 580 mikrogram / ml </td><td> L-glutamin </td><td> 580 mikrogram / ml </td></tr><tr><td> Glukos </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Glukos </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 mikrogram / ml </td><td> Gentamycin </td><td> 15 mikrogram / ml </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0.1mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Övriga Reagens: <table border="1"><tr><td> Reagens </td><td> Företag </td><td> Löpnummer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21.875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41.965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Cat Inga H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Delta Välj </td><td> Art nr 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> Cat Inga DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES Buffer </td><td> PAA </td><td> Cat Inga S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11.140 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> PAA </td><td> Cat Inga P02-015 </td></tr><tr><td> Rekombinant murin Interleukin-4 </td><td> Immunotools </td><td> Katt Inga 12340045 </td></tr><tr><td> Ciklosporin A </td><td> Novartis </td><td> Katt Nej NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. diverse tillbehör: <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Företag </td><td> Löpnummer </td></tr><tr><td> Sterila pipettspetsar </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-brunnar </td><td> NUNC </td><td> Katt Inga 140.675 </td></tr><tr><td> 50mL koniska röret </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Katt Inga 352.070 </td></tr><tr><td> Vävnadskultur kolv </td><td> Sarstedt </td><td> Katt Nej 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

Forskning om B-celler har visat att CD40 aktivering förbättrar deras kapacitet antigen presentation. När stimuleras med interleukin-4 och CD40 ligand (CD40L) kan mänskliga B-celler utökas utan svårigheter från små mängder av perifert blod inom 14 dagar till mycket stora mängder högt ren CD40-B-celler (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Celler per patient) från friska donatorer och patienter med cancer<sup&gt; 1-4</sup&gt;. CD40-B-celler uttrycker viktiga lymfkörtel målsökande molekyler och kan locka T-celler<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Dessutom tar de effektivt upp, bearbeta och presentera antigener för T-celler<sup&gt; 6,7</sup&gt;. CD40-B-celler visades inte bara prime naiva, men också utöka celler minne T<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Därför CD40-aktiverade B-celler (CD40-B-celler) har studerats som en alternativ källa av immuno-stimulerande antigen-presenterande celler (APC) för cellbaserade immunotherapy1, 5,10. För att ytterligare studera om CD40-B-celler inducerar effektivt T-cell reaktioner in vivo och att studera den underliggande mekanismen vi etablerat ett system cellkultur för generering av murina CD40-aktiverade B-celler. Använda splenocytes eller renat B-celler från C57BL / 6 möss för CD40-aktivering, var optimala förhållanden identifieras enligt följande: Från splenocytes av C57BL / 6 möss (haplotyp H-2b) lymfocyter renas genom densitetsgradient centrifugering och co-odlade med HeLa celler som uttrycker rekombinant murin CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Celler är recultured var 3-4 dagar och nyckelkomponenter såsom CD40L, interleukin-4,-Mercaptoethanol och cyklosporin A fylls. I detta protokoll visar vi hur du får fullt aktiverad murin CD40-B-celler (mCD40B) med liknande APC-fenotyp för människors CD40-B-celler (Figur 1a, b). CD40-stimulering leder till en snabb utväxt och utbyggnad av mycket rent (&gt; 90%) CD19 + B-celler inom 14 dagar från cellodling (fig 1c, d). Att undvika kontaminering med icke-transfekterade celler, har uttryck av murina CD40 ligand på transfectants som ska kontrolleras regelbundet (Fig. 2). Murina CD40-aktiverade B-celler kan användas för att studera B-cells aktivering och differentiering, samt att undersöka deras möjligheter att fungera som APC in vitro och in vivo. Dessutom utgör de ett lovande verktyg för att skapa terapeutiska eller förebyggande vaccinering mot tumörer och hjälper till att svara på frågor om säkerhet och immunogenicitet av denna strategi<sup&gt; 12</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Murine Model of CD40-activation of B cells

I denna video visar vi förfarandet för CD40-aktivering och expansion av murina B-celler från splenocytes av C57BL / 6 möss, som kan användas som en modell antigen-presenterande celler (APC) att studera induktion av immunitet.

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induktion och Bedömning av klass Switch rekombination i Renad mus B-celler

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Rekombinant retroviral Produktion och infektion av B-celler

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Musmodell av allergen astma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Plackanalys för murin Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Upptäckt av True IgE-uttryck Mus B-celler

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En musmodell av grupp B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detection och anrikning av sällsynta antigenspecifika B-celler för analys av Fenotyp och funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analys av skjuvning flöde-inducerad Migration av murin marginella zon B-celler In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

I Vitro differentiering modell av människans normala minne B celler att långlivade plasmaceller

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...