Name: imaging mismatch repair and cellular responses to dna damage in bacillus subtilis
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis at JoVE.com

Los autores desean agradecer a los Dres. Philina S. Lee y Alan D. Grossman para la formación inicial en LAS microscopía de fluorescencia. Los autores también agradecen a los Dres. Melanie Berkmen y Kobayashi Hajime ayuda y consejos para la imagen. Este trabajo fue apoyado por la puesta en marcha de fondos de la Facultad de Literatura, Ciencias y Artes y del Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo en la Universidad de Michigan.

Cultivos en crecimiento de las células para la microscopía 1. Uno o dos días antes de la imagen, preparar el B. subtilis cepa que contiene la proteína de fusión de traducción que desea visualizar. Rondas de prueba de los pasos 1A y 1B será necesario determinar qué condiciones de crecimiento ofrece las mejores imágenes de la cepa. En la mayoría de los casos, las células deben ser fotografiado durante la fase de crecimiento exponencial. <ol class="ualpha"><li> Para alguno...

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	<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle.">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis.">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis.">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li><li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis.">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction.">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li><li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells.">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li></ol>

Ensayo y error están obligados a encontrar las condiciones de exposición de las imágenes de mayor calidad para cada cepa, nos encontramos con que una milésima de segundo es apropiado para las imágenes de luz blanca, mientras que las exposiciones de 100 a 2000 ms son apropiados para las buenas prácticas agrarias (FITC) y FM4 64 (TRITC ) imágenes. Tiempo de exposición puede variar en función de los equipos de imágenes utilizados. Se recomienda el uso de una cepa por portaobjetos de microscopio de 15 y para el m?...

Recetas específicas solución 1: S7 10x 50 sales 0,5 M MOPS 100 mM de sulfato de amonio 50 mM fosfato de potasio monobásico Filtro de esterilización, y el abrigo S7 50 medios de comunicación en papel de aluminio antes de su almacenamiento Metales 100x 0,2 M de MgCl2 70 mM de CaCl2 5 mM MnCl2 0,1 mM ZnCl2 100 mg / ml Tiamina HCl 2 mM HCl 0,5 mM FeCl 3 * dH 2 O al volumen final * FeCl 3 se añade al final, para evitar la precipitación. Después de la esterilización de filtros, envuelva 100x solución de metal en lámina. S7 50 medios de comunicación 1x S7 50 sales 1x metal 1% de glucosa 0,1% de glutamato 40 mg / mL de triptófano 40 mg / mL de fenilalanina H 2 O destilada a volumen final Spizizens 10x (g / L) 151,4 mM de sulfato de amonio (20 g / L) 803,8 mM fosfato de potasio monobásico (140 g / L) 440,9 mM fosfato de potasio dibásico (60 g / L) 34,0 mM citrato de sodio (10 g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2 g / L) dH 2 O al volumen final Filtro de esterilización

imaging mismatch repair and cellular responses to dna damage in bacillus subtilis

Tanto en procariotas y eucariotas responden al daño del ADN a través de una compleja serie de cambios fisiológicos. Alteraciones en la expresión génica, la redistribución de las proteínas existentes, y el montaje de nuevos complejos de proteínas puede ser estimulada por una variedad de lesiones en el ADN y no coincidentes de pares de bases del ADN. Microscopía de fluorescencia se ha utilizado como una poderosa herramienta experimental para la visualización y cuantificación de estas y otras respuestas a las lesiones del ADN y para supervisar el estado de replicación del ADN dentro de la compleja estructura subcelular de una célula viva. Fusiones traduccionales entre las proteínas fluorescentes reportero y los componentes de la replicación del ADN y la maquinaria de reparación se han utilizado para determinar las señales que se dirigen a proteínas de reparación del ADN de sus lesiones afines<em&gt; In vivo</em&gt; Y para entender cómo estas proteínas se organizan dentro de las células bacterianas. Además, las fusiones de transcripción y traducción vinculados a los promotores de ADN inducible daños han revelado que las células dentro de una población ha activado las respuestas de estrés genotóxico. En esta revisión, nos proporcionan un protocolo detallado para el uso de microscopía de fluorescencia a la imagen de la asamblea de la reparación del ADN y los complejos de replicación del ADN en las células bacterianas individuales. En particular, este trabajo se centra en las proteínas de reparación del ADN de imagen, la recombinación homóloga, la replicación del ADN y una proteína de SOS-inducible en<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Todos los procedimientos aquí descritos son fácilmente susceptibles de complejos de proteínas de imágenes en una variedad de especies bacterianas.

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Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Un protocolo detallado se describe para la formación de imágenes en tiempo real de los complejos de reparación del ADN en<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Células.

Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Investigación

Biología

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica<em&gt; En Vivo</em&gt; La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigar los efectos perjudiciales de baja presión Plasma esterilización sobre la supervivencia de vivir el Bacillus subtilis esporas usando el celular microscopia

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...