Name: multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00
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Dr Pramod Nehete et Mme Bharti Nehete pour le sang et les échantillons de PBMC de macaques; Ce travail a été partiellement financé par des fonds de NIH IA 46969, et tous les milieux de culture cellulaire ont été produites par le Laboratoire central des médias, qui est financé par le NIH octroi CA 16672.

Les procédures pour les analyses détaillées phénotypiques et fonctionnels du total des sous-ensembles ainsi que la mémoire des lymphocytes T peut être divisé en quatre parties: 1) la préparation des cellules et la stimulation antigénique, 2) coloration marqueur de surface, 3) coloration des cytokines intracellulaires et 4) La cytométrie en flux analyses. 1. Préparation des cellules et la stimulation antigénique <ol><li> Les deux fraîchement isolées ainsi que la cryo-préserv?...

<ol>
	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

Solution et tampons <ul><li> Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> RPMI-1640 (HyClone laboratoires, Logan, UT) </li><li> Sérum de veau fœtal (FBS), (HyClone laboratoires, Logan, UT) </li><li> L-glutamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Pénicilline / streptomycine (Invitrogen; Carlsbad, CA) </li><li> Le bleu trypan réactif (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Tris 50 mM, pH 8,6; filtrée et stocker à 4 ° C </li><li> PBS Dulbecco (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life Technologies, Rockville, MD) </li><li> Tampon de lavage de débit: supplément DPBS avec 2% de FBS, conserver à 4 ° C </li><li> BD Cytofix / Cytoperm fixation / perméabilisation Solution Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Agents d&#39;activation <ul><li> Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Ionomycine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Costimulation mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> L&#39;affinité des anticorps purifiés F (ab) 2 fragments de chèvre anti-souris IgG (H + L) (Kierkegaard et Perry laboratoire, Gaithersburg, MD) </li><li> Agents d&#39;activation spécifiques pourraient inclure des piscines peptide, le peptide seul ou protéine entière </li></ul> Inhibiteurs de la sécrétion des cytokines <ul><li> Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Branchez Golgi peuvent être utilisées alternativement (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Anticorps <ul><li> Live / Dead fixable Aqua Kit colorant fluorescent (Invitrogen; Carlsbad, CA) </li><li> CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD4 Pacific Blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA) </li><li> CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD28-PerCP Cy5.5 (L293), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IL-2 PE (MQ1-17h12), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

Le modèle macaque rhésus est actuellement le meilleur modèle disponible pour le VIH-sida à l&#39;égard de la compréhension de la pathogenèse, ainsi que pour le développement de vaccins et de thérapeutiques<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Ici, nous décrivons une méthode pour l&#39;analyse détaillée phénotypique et fonctionnelle des réponses immunitaires cellulaires, la production de cytokine spécifiquement intracellulaire par CD4 + et CD8 + ainsi que les sous-ensembles de la mémoire individuelle. Nous avons obtenu des mesures précises quantitatifs et qualitatifs pour la production d&#39;interféron gamma (IFN-) et l&#39;interleukine (IL) -2 dans les deux cellules CD4 + et CD8 + T des cellules du macaque rhésus PBMC stimulées par le PMA, plus ionomycine (PMA + I). Les profils de cytokines ont été différentes dans les différents sous-ensembles de cellules mémoire. Par ailleurs, ce protocole nous a fourni la sensibilité à démontrer, même des fractions mineures de l&#39;antigène spécifique de CD4 + et CD8 + sous-ensembles de cellules T dans les échantillons PBMC de macaques rhésus vaccinés avec un vaccin d&#39;enveloppe du VIH cocktail de peptides développés dans notre laboratoire. La technique de cytométrie en flux multicouleur est un outil puissant pour identifier précisément les différentes populations de cellules T<sup&gt; 4,5</sup&gt; Avec la cytokine capacités de production<sup&gt; 6</sup&gt; Suite à une stimulation non-spécifique ou spécifique de l&#39;antigène<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Nous démontrons l&#39;utilité de la cytométrie en flux multicouleur pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle détaillée du total des sous-ensembles ainsi que la mémoire des lymphocytes CD4 + et CD8 + T dans les macaques rhésus, le modèle idéal pour les études de vaccin contre le VIH / SIDA.

Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus

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