Name: performing and processing fna of anterior fat pad for amyloid
Uploaded: 2010-10-30T17:00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid at JoVE.com

Wij danken Mevr. Bonnie Phetteplace, RN voor hulp tijdens de video-grafieken van de FNAB procedure demonstratie.

Introductie Systemische amyloïdose is een zeer variabel ziekte die verwijst naar de extracellulaire afzetting van verschillende eiwitten die gezamenlijk worden aangeduid als amyloid. Afzetting van amyloid fibrillen met deze beta geplooide configuratie leidt tot verschillende klinische presentaties, afhankelijk van de betrokken organen. De klinisch meest relevante manifestaties van systemische amyloïdose worden genoteerd wanneer er sprake is betrokkenheid van de kritieke organen zoals het hart, de lever en / of nieren. Historisch gezien, zouden deze betrokken organen worden gebiopteerd aan de aanwezigheid van amyloïde te tonen. Deze matig invasieve procedures droeg een aanzienlijk risico met bloeding. Vetkussentje aspiratie is inmiddels aangetoond dat het een betrouwbare en niet-invasieve methode voor de detectie van amyloïde in systemische amyloïdose een te verstrekken. Deze procedure is in wezen vergelijkbaar met de liposuctie van het onderhuidse vet in de voorste buikwand onder plaatselijke verdoving te fibroadipose weefsel op te halen voor het evalueren van weinig amyloïd afzettingen in de kleine bloedvaten wanden 2. De meest gebruikte methode voor identificatie amyloïd in weefsel blijft de karakteristieke appelgroene dubbelbreking patroon zien als Congo rood gekleurde coupes worden gevisualiseerd in een gepolariseerde lichtmicroscoop 3. Wanneer vet pad aspiratie wordt uitgevoerd, kan Congo rode vlekken worden gedaan op zowel de directe uitgesmeerd dia&#39;s of celblok voorbereidingen van het vetweefsel weggezogen. Echter, patiënten in de vroege stadia van amyloïdose hebben weinig amyloid deposito&#39;s, die sterk vermindert de gevoeligheid van Congo rood gekleurde cel blokkeren secties 4,5. Ultrastructurele evaluatie van vet pad aspiraten met behulp van elektronenmicroscopie heeft een betere reproduceerbaarheid en verbeterde gevoeligheid 4. Daarom is het aan te raden om al het vet pad zuigt in te dienen voor zowel de voorbereiding van een cel blok en voor het uitvoeren van elektronenmicroscopie 2. Vetkussentje aspiratie is een relatief goedkope en niet-invasieve methode voor het verkrijgen van weefsel systemische amyloïdose vast te stellen. Dit artikel beschrijft vetkussentje aspiratie procedure samen met de details over het monster verwerking exemplaar in te dienen voor zowel Congo rode vlekken en ultrastructurele evaluatie door elektronenmicroscopie. In deze video, tonen we deze reproduceerbare en eenvoudige procedure om een ​​optimale diagnostisch materiaal op te halen. 1. Het uitvoeren van de FNA van Anterior Fat Pad A. verdoving van de lokale omgeving (zie figuur 1 &amp; 2) <ol><li> Met behulp van alcoholdoekjes of het huidreinigingsmiddel, de voorkeur van een bepaalde instelling, het reinigen van de huid op de onderste kwadrant gedeelte van de buik lateraal van de middellijn en onder de navel (figuur 1). </li><li> Markeer een ruitvormige vormig gebied ongeveer 2 x 2 cm, zoals aangegeven in figuur 1 met een markering pen. </li><li> Aspireren ongeveer 10 ml van 1% lidocaïne met een 18G naald. Bevestig een 25G 1 ½ inch naald op de spuit. Verwijder eventuele ingesloten lucht door te tikken op de spuit rechtop terwijl u op de zuiger tot vloeistof is afgegeven en er geen luchtbellen aanwezig zijn. </li><li> Verdoven langs de grenzen van het ruitvormige gebied al aangeduid als weergegeven in figuur 2. Begin met het inbrengen van de naald 25G net onder de huid bij punt A en zorgvuldig subcutaan duw de naald naar punt X terug te Trek aan de zuiger om ervoor te zorgen dat u niet binnen een schip. Vervolgens duw de zuiger langzaam op te infiltreren tot 2,5 ml lidocaïne (ongeveer ¼ van de lidocaïne in 10 ml spuit), terwijl het intrekken van de naald naar punt A zonder dat de naald naar buiten komen van de huid op punt A (figuur 2A3). Met de naald nog wijzigen onder de huid de richting punt Y (figuur 2A4) en subcutaan duw de naald naar punt Y (Figuur 2b1). Net als voorheen, te bevestigen dat de naald niet in een vat en breng ongeveer 2,5 ml lidocaïne, terwijl langzaam het intrekken van de naald door punt A (zie figuur 2B3 door 2B4). Herhaal dezelfde stappen vanaf punt B en het doseren van lidocaïne subcutane van de punten B tot X en B naar Y (figuur 2C1 door 2d4). Te voorkomen dat bloeden van de prikken A en B door firma toepassing van steriele meter stuk. </li><li> U kunt nu controleren dat het gebied wordt verdoofd door licht aanraken van de huid binnen de verdoofde ruit met de punt / hoek van katoen gaas stuk, door deze te vergelijken met aangrenzende unanesthetized huid. </li></ol> B. Het uitvoeren van vetkussentje aspiratie (Figuur 3) (Toepassing van lokale anesthesie voorafgaand aan de prestaties van vet pad aspiratie kan worden overbrugd, afhankelijk van de regionale en individuele voorkeuren. Correct is uitgevoerd FNAB procedure voor de voorste vetkussentje aspiratie kan worden ingevuld in een prik. Echter, afhankelijk van de pijngrens van de individuele patiënt , manoeuvreren van 18 G naald heen en weer in het onderhuidse vetweefsel is relatief distreszingen. De verdoving hier beschreven methode bereikt het effect in slechts twee prikken met een 25G naald en afwendt van de pijn met een verbeterde tolerantie voor de procedure.) <ol><li> Monteer 18G 1 ½ inch naald op een 10 ml spuit. Monteer de spuit-naald assemblage in de spuit greep (&quot;FNAB grip / geweer &#39;) voor de juiste toepassing en het vrijgeven van vacuüm. </li><li> Steek de punt van de naald in het onderhuidse vet in het gereinigd en verdoofde ruitvormige gebied (Figuur 3a). </li><li> Volledig in te trekken van de zuiger van de spuit met de naald in het onderhuidse weefsel om vacuüm (figuur 3b) te genereren. </li><li> Handhaving van de stofzuiger en manoeuvreren van de naald heen en weer in verschillende richtingen in het onderhuidse vet (figuur 3c door 3i). Elke slag moet zo lang mogelijk te zijn met de lengte van de naald geselecteerde zonder dat de naald komt uit de huid. Maximale sampling wordt bereikt door het veranderen van richting met elke slag (Figuur 3i). Het is belangrijk om de richting van de naald raakt aan de serosa en parallel aan het huidoppervlak om te voorkomen dat het doorprikken van de buikholte. </li><li> De fibroadipose weefsel hoopt zich op in de spuit. Zodra er voldoende fibroadipose weefselfragmenten (tot 1 mL van fragmenten rijk bloed vermengd specimen) worden opgehaald, volledig los van de stofzuiger en verwijder de naald (afbeelding 3k). </li><li> Laat de patiënt of de assistent stevige druk toe te passen op het gebied van de procedure met een kussen van gaas om extravasatie van bloed te voorkomen. </li></ol> 2. Specimen Processing <ol><li> Plaats minimaal 5-6 fragmenten van fibroadipose weefsel in glutaaraldehyde-oplossing voor elektronenmicroscopie (Figuur 4B). </li><li> Afhankelijk van de institutionele protocol, kunnen een paar uitstrijkjes van de fibroadipose weefselfragmenten worden voorbereid door het verspreiden van deze tussen twee dia&#39;s (Figuur 4A). </li><li> Het resterende materiaal is toegestaan ​​te stollen in de spuit (dit kan 5-7 minuten, afhankelijk van de stollingstijd) (Figuur 4C). </li><li> Aspireren 10% formaline in de spuit, zodat de clotted fibroadipose weefsel materiaal is verdreven van de wand van de spuit en de vrij zwevende (figuur 4C2). Verwijder de zuiger van de spuit (Figuur 4C3) en breng de clotted fibroadipose weefsel in de 10% formaline container van het open uiteinde van de spuit tegenover de sproeieruiteinde (Figuur 4C4). </li><li> Passend etiket van de containers en legt de glutaraldehyde voor elektronenmicroscopie en de formaline voor H &amp; E sectie en Congo rode vlek voor de evaluatie in het kader polariserende microscopie. Als uitstrijkjes zijn voorbereid, kunnen ze worden verwerkt volgens het protocol van het betreffende laboratorium. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Gebied om onder narcose te zijn voor FNAB van anterior vet pad. <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Verdoving van de omgeving. <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Het uitvoeren van FNAB van de voorste vet pad. <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Verwerking van de voorste vetkussentje aspireren te worden voorgelegd aan het laboratorium voor de detectie van amyloïd afzettingen. 3. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Amyloïde in de wand van kleine bloedvaten in fibroadipose weefselfragmenten. Fibroadipose weefsel was formaline-verwerkt, paraffine ingebed, gekleurd met Congo rood, en onderzocht door polariserende lichtmicroscopie. Amyloïde in de wand van kleine bloedvaten toont appel groene dubbelbreking (witte pijl). <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Tissue ontbreekt amyloïdose. De appel groene dubbelbreking is afwezig in de weefsels van een andere patiënt zonder amyloïdose. Blauw dubbele breking (witte pijl) van collageen vezels, zijn meestal aanwezig in bijna alle exemplaren. <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig7.jpg" alt="Figuur 7" /> Figuur 7. Fibrillen in overeenstemming met amyloid in de vaatwand. Electron microfoto van rechte, niet-vertakkende, willekeurig verspreide 80-10 nm diameter fibrillen gevormd door amyloïde in de vaatwand.

<ol>
	<li>Westermark, P., Stenkvist, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+diagnosis+of+systemic+amyloidosis.">A new method for the diagnosis of systemic amyloidosis.</a> Arch Intern Med. 132, 522-523 (1973).</li><li>Devata, S., Hari, P., Markelova, N., Li, R., Shidham, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+AL+Amyloid+in+Abdominal+fat+pad+aspirates:+Is+Congo+red+sufficient?.">Detecting AL Amyloid in Abdominal fat pad aspirates: Is Congo red sufficient?.</a> Amyloid. , .</li><li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+of+Amyloidosis.">Molecular Mechanisms of Amyloidosis.</a> New Engl J Med. 349 (6), 583-596 (2003).</li><li>Shidham, V. B., Kumar, N., Cihlar, K., Varsegi, G., Markelova, N., Li, R., Hari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+needle+aspiration+of+abdominal+fat+pad+for+diagnosis+of+early+amyloidosis:+How+can+the+clinical+role+of+the+test+be+improved?.">Fine needle aspiration of abdominal fat pad for diagnosis of early amyloidosis: How can the clinical role of the test be improved?.</a> Mod Pathol. 20, 1A-380A (2007).</li><li>Halloush, R., Lavrovskaya, E., Mody, D., Lager, D., Truong, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+typing+of+systemic+amyloidosis:+The+role+of+abdominal+fat+pad+fine+needle+aspiration.">Diagnosis and typing of systemic amyloidosis: The role of abdominal fat pad fine needle aspiration.</a> Cytojournal. 6, 24-24 (2010).</li><li>Hazenberg, I. I., Rijswijk, C. V. a. n., H, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Accuracy+of+Subcutaneous+Abdominal+Fat+Tissue+Aspiration+for+Detecting+Systemic+Amyloidosis+and+Its+Utility+in+Clinical+Practice.">Diagnostic Accuracy of Subcutaneous Abdominal Fat Tissue Aspiration for Detecting Systemic Amyloidosis and Its Utility in Clinical Practice.</a> Arthritis Rheum. , 54-546 (2006).</li><li>Guy, C. D., Jones, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+fat+pad+aspiration+biopsy+for+tissue+confirmation+of+systemic+amyloidosis:+specificity,+positive+predictive+value,+and+diagnostic+pitfalls.">Abdominal fat pad aspiration biopsy for tissue confirmation of systemic amyloidosis: specificity, positive predictive value, and diagnostic pitfalls.</a> Diagn Cytopathol. 24, 181-185 (2001).</li><li>Westermark, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+Amyloidosis.">Diagnosing Amyloidosis.</a> Scand J Rheumatol Suppl. 24, 327-329 (1995).</li><li>Linke, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Diagnosis+of+Amyloid+and+Various+Amyloid+Syndromes+Using+Congo+Red+Fluorescence.">Highly Sensitive Diagnosis of Amyloid and Various Amyloid Syndromes Using Congo Red Fluorescence.</a> Virchow Arch. 436, 439-448 (2000).</li><li>Giorgadze, T. A., Shiina, N., Baloch, Z. W., Tomaszewski, J. E., Gupta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+amyloid+in+fat+pad+aspiration:+an+evaluation+of+Congo+red+stain+by+fluorescent+microscopy.">Improved detection of amyloid in fat pad aspiration: an evaluation of Congo red stain by fluorescent microscopy.</a> Diagn Cytopathol. 31, 300-306 (2004).</li><li>DeMay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+Needle+Aspiration+Biopsy.">Fine Needle Aspiration Biopsy.</a> The Art &#38; Science of Cytopathology. , 465-46 (1996).</li><li>Arbustini, E., Vrga, L., Concardi, M., Pallandini, G., Obici, L., Merlini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+and+Immuno-electron+Microscopy+of+Abdominal+Fat+Identifies+and+Characterizes+Amyloid+Fibrils+in+Suspected+Cardiac+Amyloidosis.">Electron and Immuno-electron Microscopy of Abdominal Fat Identifies and Characterizes Amyloid Fibrils in Suspected Cardiac Amyloidosis.</a> Amyloid. 9, 108-114 (2002).</li></ol>

De diagnose van amyloïdose wordt meestal bereikt met een tissue biopsie van de aangedane organen zoals de nieren, de lever en / of het hart. Deze aanpak heeft een hoge diagnostische opbrengst is echter invasief en kan gepaard gaan met complicaties zoals bloedingen 2. Rectaal, tandvlees, en het beenmerg biopsieën men de voorkeur voor de diagnose als relatief minder invasieve aanpak in 1960 6,7,8. Buikvet pad aspiratie werd gerapporteerd in 1973 als een veilige, minimaal invasieve, eenvoudige en minder dure procedure voor het weefsel diagnose van systemische amyloïdose 1. Echter, de details van de procedure en aanpak van de verwerking van de opgehaalde monster niet coherent gemeld. Deze video en het artikel beschrijven de procedure stap voor stap. De aanpak voor het opsporen van amyloid in vet pad aspiratie, net, is ook niet goed gestandaardiseerd met een paar studies vergelijken en evalueren van verschillende benaderingen 1,5,6,7,8. Evaluatie van de voorste vetkussentje zuigt met Congo rood kleuring is minder gevoelig met een lager interobserver reproduceerbaarheid vooral in het begin gevallen van amyloïdose met weinig amyloïd afzettingen 5. Immunohistochemie uitgevoerd op formaline gefixeerd paraffine ingebedde celblok secties en Congo rode fluorescentie uitgevoerd op cytologie uitstrijkjes zijn gemeld aan de diagnostische gevoeligheid 9,10 te verbeteren. Elektronenmicroscopie verbetert de detectie en identificatie van geringe amyloïd fibrillen in kleine wanden van bloedvaten in de fibroadipose weefsel in vet pad zuigt 4, 5. Op basis van deze informatie, dit artikel beschrijft de verwerking van het monster naar cel blokken (voor de evaluatie van Congo rood gekleurde celblok secties onder polarisatie microscoop voor diagnostische appelgroen dubbelbreking en ook voor immunohistochemie zoals aangegeven) en voor elektronenmicroscopie voor te bereiden. Echter, afhankelijk van de gekozen aanpak voor de evaluatie van het monster voor het amyloid, kan het worden onderworpen aan cytologie uitstrijkje voorbereiding, celblok voorbereiding en verwerking voor elektronenmicroscopie. Sommige laboratoria uitvoeren van de tests op de uitstrijkjes bereid uit de aangezogen fibroadipose weefselfragmenten en gekleurd met Congo rood naar de fluorescentie 10 studiepunten. Over het algemeen in een late amyloïdose, kan de lichtmicroscopie met Congo rood polariserende microscopie voldoende, maar in de vroege stadia van de ziekte Congo rood kleuring met polariserende microscopie op celblok secties is minder gevoelig en betrouwbaar voor vetkussentje zuigt 4,5,11 . Andere speciale vlekken inclusief thioflavin T kan gebruikt worden met dezelfde beperkingen. Andere benaderingen van amyloid sporen bestaan ​​uit de beoordeling van het aspiraat uitstrijkjes voor het amyloid met Congo rood polariserend microscopie en fluorescentie 10. In onze ervaring is deze methode minder reproduceerbaar. Evaluatie van de bloedvaten in vet pad voor amyloïde met behulp van elektronenmicroscopie overwint deze beperkingen 4,11. Verdere karakterisering van amyloid is gemeld door de immunoelectron microscopie 12, maar deze methoden niet op grote schaal beschikbaar zijn in een niet-tertiaire zorg instelling. Naalden worden gebruikt voor het uitvoeren van aspiratie procedures kunnen worden ingedeeld volgens hun peilen maten in fijne (21-25G), tussenproduct (18-20G) en grote (bijv.-14G) 11. Anterieure vetkussentje aspiraties zijn gemeld te worden uitgevoerd met behulp van een variabele kalibers gaande van tussenproduct (18 tot 20G) naar fijn (21 tot en met 22G) 2,10. De meeste van de massa-laesies zijn opgezogen met fijnere gauge naalden (zoals 25G) om een ​​goede cytologie uitstrijkjes te krijgen, samen met extra bewegingen met bredere gauge naald (zoals 18G) om extra monsters op te halen voor cel-blokken. Tijdens de voorste vetkussentje aspiratie, wordt de samenhangende fibroadipose weefsel niet goed te zuigen met fijnere naalden. Cellenblok voorbereiding en elektronenmicroscopie zijn belangrijk voor de evaluatie van de kleine bloedvaten muren in fibroadipose weefsel fragmenten in het vet zuigt. Bredere gauge naalden (zoals 18G) worden aanbevolen om diagnostisch adequaat materiaal 2,10 opleveren. Als de procedure is vergelijkbaar met de conventionele FNAB, is vet pad streven aangeduid als FNAB ook al breder gauge naalden kan worden gebruikt voor het uitvoeren van het 5.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/index/details.stp?id=1747">Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Safwan S. Jaradeh
instead of:
Safwan S. Jardeh

Erratum: Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Alcoholdoekjes, gaasjes, markering pen, 10 ml spuiten x2, 1% lidocaïne (lokaal verdovingsmiddel lidocaïne-Als alleen wordt gebruikt, veroorzaakt het een eerste branderig gevoel na indruppelen. Dit kan worden voorkomen door het gebruik van een 1:1 mengsel van 1% lidocaïne en 1% natrium-bi-carbonaat), 18 gauge (G) 1 ½ inch naalden x2 (voor het uitvoeren van FNAB), 25G 1 ½ inch naald (voor het inspuiten van lokale verdoving), FNA spuit houder (&quot;gun&quot;), verband, flacon glutaraldehyde (voor elektronenmicroscopie) en biopsie container van 10% formaline.

performing and processing fna of anterior fat pad for amyloid

Historisch gezien, werd het hart, de lever en nieren biopsieën uitgevoerd om amyloïdeafzettingen demonstreren in amyloïdose. Omdat de klinische presentatie van deze ziekte is zo variabel en niet-specifieke, de daaraan verbonden risico&#39;s van deze biopten zijn te groot voor de diagnostische opbrengst. Andere sites die een lagere biopsie risico, zoals huid of gingivale hebben, zijn ook relatief invasief en duur. Daarnaast kunnen deze biopsies niet altijd over voldoende amyloïdeafzettingen om een ​​diagnose te stellen. Vetkussentje aspiratie heeft aangetoond een goede klinische correlatie met lage kosten en minimale morbiditeit. Echter, er zijn geen gestandaardiseerde protocollen voor het uitvoeren van deze procedure of verwerking van de aangezogen monster, wat leidt tot variabele en nonreproducible resultaten. De meest gebruikte modaliteit voor het opsporen van amyloïd in weefsel is een appelgroene dubbelbreking op Congo rood gekleurde coupes met behulp van een polariserende microscoop. Deze techniek vereist celblok voorbereiding van de opgezogen materiaal. Helaas, patiënten die in een vroeg stadium van amyloïdose hebben minimale hoeveelheden amyloïde, die sterk vermindert de gevoeligheid van Congo rood gekleurde celblok delen van vet pad aspiraten. Daarom moet ultrastructurele evaluatie van vet pad aspiraten met behulp van elektronenmicroscopie worden gebruikt, gezien de verhoogde gevoeligheid voor amyloid detectie. Dit artikel toont een eenvoudige en reproduceerbare procedure voor het uitvoeren van anterior vetkussentje aspiratie voor de detectie van amyloïde gebruik te maken van zowel Congo rood kleuring van cellen te blokkeren profielen en elektronenmicroscopie voor ultrastructurele identificatie.

Watch this Scientific Journal Video about Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid at JoVE.com

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Vetkussentje aspiratie is een voorkeur, minimaal invasieve, en lage kosten aanpak in vergelijking met andere methoden om amyloïd te detecteren voor de diagnose van systemische amyloïdose. Deze video artikel wordt een procedurele schets voor het uitvoeren van dikke pad aspiratie met de juiste verwerking van het monster voor de optimale diagnostische resultaat.

Uitvoeren en verwerken van de FNA-anterior Fat Pad voor Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

performing-and-processing-fna-of-anterior-fat-pad-for-amyloid

Research

JoVE Journal

Medicine

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a large extracellular domain and a short cytosolic domain termed the APP intracellular domain (AICD). During maturation through the secretory pathway, APP can be cleaved by proteases termed &alpha;, &beta;, and &gamma;-secretases1. Sequential proteolytic cleavage of APP with &beta; and &gamma;-secretases leads to the production of a small proteolytic peptide, termed A&beta;, which is amyloidogenic and the core constituent of senile plaques. The AICD is also liberated from the membrane after secretase processing, and through interactions with Fe65 and Tip60, can translocate to the nucleus to participate in transcription regulation of multiple target genes2,3. Protein-protein interactions involving the AICD may affect trafficking, processing, and cellular functions of holo-APP and its C-terminal fragments. We have recently shown that AICD can aggregate in vitro, and this process is inhibited by the AD-implicated molecular chaperone ubiquilin-14. Consistent with these findings, the AICD has exposed hydrophobic domains and is intrinsically disordered in vitro5,6, however it obtains stable secondary structure when bound to Fe657. We have proposed that ubiquilin-1 prevents inappropriate inter- and intramolecular interactions of AICD, preventing aggregation in vitro and in intact cells4. While most studies focus on the role of APP in the pathogenesis of AD, the role of AICD in this process is not clear. Expression of AICD has been shown to induce apoptosis8, to modulate signaling pathways9, and to regulate calcium signaling10. Over-expression of AICD and Fe65 in a transgenic mouse model induces Alzheimer's like pathology11, and recently AICD has been detected in brain lysates by western blotting when using appropriate antigen retrieval techniques12. To facilitate structural, biochemical, and biophysical studies of the AICD, we have developed a procedure to produce recombinantly large amounts of highly pure AICD protein. We further describe a method for inducing the in vitro thermal aggregation of AICD and analysis by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical, biophysical, and structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on AICD aggregation.

A method for large-scale purification of the APP intracellular domain (AICD) is described. We also describe methodology to induce in vitro AICD aggregation and visualization by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical/structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on its aggregation.

Zuivering en Aggregatie van het amyloïde voorlopereiwit intracellulaire domein

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Beoordeling van de levensvatbaarheid van menselijk vet Injectie in Naakt Muizen met Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

Transplantatie in de muis ovariële vet pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.

During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.

Bevestiging van de Myocardiale ischemie en reperfusie schade in Muizen met behulp van Surface Pad elektrocardiografie

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a novel treatment of symptomatic end-neuromata of peripheral sensory nerves, and in this study, specifically of the superficial branch of the radial nerve (SBRN). Despite a multitude of existing treatments, persistent postoperative pain and common pain relapse are still very common, independent of the procedure assessed. The neuroma is microsurgically excised accordingly to standardized protocol. Instead of the relocation of the regenerating nerve stump in neighboring anatomical structures, such as muscle or bone, a fat graft is applied perifocally and acts as a mechanical barrier. In order to reduce the fat resorption rate and boost the regenerative potential of the graft, the highly concentrated SVF is integrated in the grafting. The SVF is isolated from subcutaneous fat by enzymatic and mechanic separation of the lipoaspirate by a specific commercial isolation system. The SVF-enriched fat graft provides both a mechanical barrier and various biological effects at the cellular level, including improving angiogenesis, inflammation, and fibrosis. Both mechanical and biologic effects help to reduce the disorganized axonal outgrowth of the nerve stump during nerve regeneration and hence prevent the recurrence of painful end-neuromata.

The purpose of the study is to illustrate the technical procedure of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a novel treatment of symptomatic end-neuromata. This technique provides advantages of both the mechanical barrier and the biological action at the cellular level by the processed and concentrated SVF.

Stromale vasculaire breuk-verrijkt vet enten voor de behandeling van symptomatische einde-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Methodologie voor Sputum inductie en laboratorium Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Bemonsteringsstrategie en verwerking van Biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

A Training and Testing System for Performing Vascular Reconstruction In Vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has yet to be developed. In this study, we introduce an in vitro training and testing system using a magnetic anchoring technique with which a trainee can practice manual vascular reconstruction individually. Additionally, this system can also be used to test the quality of the reconstruction. The described system includes a vascular reconstruction training machine, magnetic tractors, and a magnetic suture puller. In this manuscript, we detail an end-to-end vein anastomosis using porcine right and left iliac veins. To identify the potential damage caused by a magnetic suture puller on the suture, we created three groups with six segments of 4-0 polypropylene sutures each: a control group with no intervention on the polypropylene suture, a group in which the polypropylene suture is manually pulled with sterile gloves 20x, and a magnetic puller group in which the magnetic puller pulled the polypropylene suture 20x. These groups were tested by light microscopy and breaking strength tests, and the effect of reconstruction was assessed. In the light microscopy test, the control group was less likely to be damaged (p &#60; 0.05) and the number of damaged points of the manual group and magnetic puller group were similar (p &#62; 0.05). The results of the breaking strength test were compared across groups and no significant difference was observed (p &#62; 0.05). The end-to-end anastomosis of the porcine iliac veins was successfully performed using this training system, and the reconstructed veins could undergo 2.0 kPa perfusion pressure. Using this training and testing system the trainee can practice manual vascular reconstruction in vitro individually with the aid of magnetic tractors and a magnetic suture puller, and the quality of the reconstruction can be tested.

Here we present a training and testing system where a trainee can complete manual vascular reconstruction in vitro individually using a magnetic anchoring technique. The system can also be used to test the quality of reconstruction.

Een trainings-en testsysteem voor het uitvoeren van vasculaire wederopbouw in vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has ...