Name: studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00
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キイロショウジョウバエ神経筋接合部の1）準備（NMJ） <ol><li>標準ショウジョウバエ生理食塩水を（130 mMのNaCl、36 mMスクロース、5mMのKClを、2mMのCaCl 2を 、2mMのMgCl 2、5mMのHepes緩衝液、pH 7.3 4準備。 </li><li>生理食塩水（1.1）の準備を細かく分析。ショウジョウバエの幼虫は、Sylgard皿に背側を上向きにしてpinedされ、背側には長手方向の切片であり、そして内臓は...

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。 <ul><li> DABのインキュベーションは、準備の徹底した洗浄と急冷後に行ってください。そうでなければ非反応グルタルアルデヒドは、DABと相互作用し、（通常は高密度電子ではないフラットな結晶の形で）その降水量が発生します。この降水量が豊富に行われる準備は、電子顕微鏡のためまれに使用できます。 </li><li>照明時間は、異?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

形質膜（エキソサイトーシス）とシナプス小胞の融合は、神経伝達物質の放出と神経細胞のコミュニケーションに必要なステップです。彼らは新しいエキソおよびエンドサイトーシスのサイクル（小胞のリサイクル）を受けるまで、小胞はその後、形質膜（エンドサイトーシス）から取得し、神経終末内の小胞の一般的なプールと一緒にグループ化されます。これらのプロセスは、電子顕微鏡、電気生理学的記録、アンペロメトリーとキャパシタンスの測定など、さまざまな手法を用いて研究されている。重要なのは、最後の二十年の間に蛍光標識したマーカーの数は、光学技術は、そのリサイクルのダイナミクスに小胞を追跡できるように、浮上した。最も一般的に使用されるマーカーの一つは、スチリルまたはFM色素1であり、構造的に、すべてのFM色素は親水性の頭部と芳香環と1つまたは複数の二重結合（図1B）を介して接続親油性尾が含まれています。小胞のプールをラベル付けするために古典的なFM色素の実験は、神経の刺激（電気的または高K +の）中に色素と（図1Ai）準備の入浴で構成されています。これは最近、エンドサイトーシス小胞（図1A I - III）に小胞のリサイクルと染料のその後のロードを誘発する。染料、色素フリーバスの刺激の第二ラウンドで小胞をロードした後にエキソサイトーシスを介してFMのリリース（図1A IV - V）、蛍光強度の減少（脱色）を監視し続けることができますプロセスの引き金となるでしょう。 FM色素が小胞のリサイクルの分野に大きく貢献しているが、それは従来の蛍光顕微鏡を使用して、個々の小胞の正確な局在や形態を決定することはできません。また、光変換を介して、電子顕微鏡を用いてエンドサイトーシスのマーカーとして使用する方法をFM色素そのため、我々はここで説明する。光電変換技術は、強烈な照明下での活性酸素種を生成する蛍光色素のプロパティを利用している。蛍光標識された調製物は、ジアミノベンジジン（DAB）を含む溶液に浸漬し、点灯されています。色素分子によって生成される反応種は暗い外観を持っているし、簡単に電子顕微鏡2,3で区別することができる安定した、不溶性の沈殿物を形成するDABを、酸化する。 DABにのみ蛍光分子（活性酸素種は短命であるため）のすぐ近くに酸化されるように、テクニックだけ蛍光標識構造は電子密度の高い沈殿物を含むとしていることを保証します。テクニックは、このように積極的に細胞内小器官のリサイクルの正確な位置と形態の研究をすることができます。

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

FM色素は、シナプスのダイナミクスの理解に非常に貴重な助けとなった。 FMSは、通常、異なる刺激条件の中に蛍光顕微鏡下で続いている。しかし、電子顕微鏡と組み合わせてFM色素の光変換は、シナプスboutonsで、他の超微細構造のコンポーネント間で、明確なシナプス小胞プールの可視化が可能になります。

スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

神経科学

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...