Name: laser microdissection applied to gene expression profiling of subset of cells from the drosophila wing disc
Uploaded: 2010-04-30T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc at JoVE.com

De auteurs danken prof.. Chiara Campanella en AMRA Center of Competence, Universiteit van Napels Federico II, Napels, Italië, hen te voorzien van het gebruik van de laser microdissector, en de heer Vincenzo Vicidomini voor genereuze hulp in de 3D-animatie.

Deel 1. De voorbereiding van Drosophila imaginaire Wing Discs onderworpen aan specifieke en lokale RNAi. Als biologisch materiaal, gebruikten we Drosophila verbeelding vleugels schijven verkregen uit transgene larven onderworpen aan de lokale en specifieke gene silencing door middel van het GAL4/UAS systeem 1. Deze larven nageslacht orginates van een genetische kruising waarbij twee ouders lijnen: een uitvoering van de GAL4 bestuurder, de tweede de UAS responder. I...

<ol>
	<li>Elliott, D. A., Brand, A. H., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GAL4+System+A+Versatile+System+for+the+Expression+of+Gene.">The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene.</a> , (2008).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.+.">Wing disc development in the fly: the early stages. .</a> Current Opinion in Genetics &#38; Development. 11, 470-475 (2001).</li><li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li><li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li><li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+morphogen+gradients.">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li><li>Moreno, E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dMyc+transforms+cells+into+super-competitors.">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li></ol>

Met betrekking tot hun basale expressie niveau bereikt in het voorste / achterste compartimenten van unsilenced vleugel schijven, was de activiteit van de geselecteerde gen X gevonden verlaagd tot 40% na zwijgen op te leggen. In tegenstelling, was een van zijn vermeende doelen (genen Y) significant gevonden up-gereguleerd (7 voudige-toename), die ons tot de hypothese te bevestigen dat het negatief was geregeld door Gene X. We concluderen dat de hierboven beschreven experimentele benadering s...

Fly stammen Drosophila UAS-silencing lijnen kunnen worden verkregen bij VDRC RNAi collectie 2. Een verzameling van GAL4-driver lijnen is beschikbaar op de Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Uitrusting Benodigde apparatuur omvat Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter microfuge 22R (Beekman), PCR (BIO-RAD My Renner), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Gereedschap Benodigde gereedschappen zijn onder andere: glas putten, borstel, microdissectie tang, opknoping druppel dia&#39;s, insect pinnen gemonteerd op spuit naalden, metalen frames met een PET-membraan, plastic buizen (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).

laser microdissection applied to gene expression profiling of subset of cells from the drosophila wing disc

Heterogene karakter van de weefsels heeft zich bewezen als een beperkende factor zijn in de hoeveelheid informatie die kan worden gegenereerd op basis van biologische monsters, ten koste gaat stroomafwaarts analyses. Gezien de complexe en dynamische cellulaire verenigingen bestaande in vele weefsels, om de in-vivo-interacties diepgaande moleculaire analyse samenvatten men moet in staat zijn om specifieke celpopulaties te analyseren in hun oorspronkelijke context. Laser-gemedieerde microdissectie kan dit doel te bereiken, waardoor ondubbelzinnige identificatie en succesvolle oogst van cellen van belang in de directe microscopische visualisatie met behoud van moleculaire integriteit. We hebben paste deze technologie om de genexpressie te analyseren in bepaalde gebieden van de ontwikkeling van Drosophila vleugel schijf, die een voordelig modelsysteem om de groei controleren, celdifferentiatie en organogenese studie vertegenwoordigt. Larvale verbeelding schijven zijn vroegtijdig onderverdeeld in voorste en achterste, dorsale en ventrale compartimenten door afkomst beperking grenzen. Door gebruik te maken van het induceerbare GAL4-UAS binaire expressie systeem, elk van deze compartimenten kunnen specifiek worden geëtiketteerd in transgene vliegen hebben een UAS-GFP transgene onder de controle van de juiste GAL4-driver te construeren. In de transgene schijven, kan de genexpressie profilering van discrete subsets van cellen nauwkeurig kan worden bepaald na de laser-gemedieerde microdissection, met behulp van de TL-GFP signaal naar laser gesneden gids. Onder de variëteit van downstream-toepassingen, hebben we ons gericht op de RNA-transcript profilering na gelokaliseerde RNA-interferentie (RNAi). Met de komst van RNAi-technologie, kan de etikettering GFP gekoppeld worden met gelokaliseerde knockdown van een bepaald gen, het mogelijk maakt om de transcriptionele respons van een discrete celpopulatie aan de specifieke gen-silencing bepaald. Om deze aanpak te valideren, we ontleed gelijkwaardige gebieden van de schijf van de achterste (gelabeld door GFP expressie), en de voorste (ongelabelde) compartiment op het regionale zwijgen op te leggen in de P-compartiment van een alom anders uitgedrukt gen. RNA werd geëxtraheerd uit gemicrodissecteerde zwijgen opgelegd en unsilenced gebieden en vergelijkende gen expressie profilering bepaald door kwantitatieve real-time RT-PCR. We laten zien dat deze methode effectief kan worden toegepast voor nauwkeurige transcriptomics van subsets van cellen in het Drosophila imaginaire schijven. Sterker nog, terwijl de grote schijf voorbereiding als bron van RNA over het algemeen veronderstelt cel homogeniteit, is het algemeen bekend dat transcriptionele expressie sterk kan variëren binnen deze structuren ten gevolge van positionele informatie. Met behulp van gelokaliseerde fluorescerende GFP signaal naar laser gesneden gids, kunnen meer accurate transcriptie analyses worden uitgevoerd en winstgevend toegepast op uiteenlopende toepassingen, waaronder transcript profilering van verschillende cellijnen in hun oorspronkelijke context.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection werd toegepast op de gen expressie profilering te analyseren in specifieke compartimenten van Drosophila vleugel schijf onderworpen aan een gelokaliseerde RNAi<em&gt; In vivo</em&gt;. RNA geëxtraheerd uit gelijkwaardige gebieden van zwijgen en unsilenced compartimenten werd geanalyseerd door kwantitatieve RT-PCR vergelijkende gen expressie profilering vast te stellen in het kader van inheemse weefsel microecology.

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microdissectie van weefsel van zoogdieren

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffine ingebedde en vriescoupes van Drosophila Adult Spieren

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Meting van Metabolic Rate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gebruik respirometrietest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...